Shuttle Box Assay som et assosiativt læringsverktøy for kognitiv vurdering i lærings- og minnestudier ved hjelp av voksen sebrafisk

Shuttle Box Assay sporer reprodusering og gjenoppretting av kognitiv svikt etter et stump krafttraume eller annen type hjerneskade i sebrafisk. Shuttle Box Assay muliggjør relativt enkel, rask og robust måling av assosiativ læring i både kort og langsiktig minne i sebrafisk. Til å begynne med, forbered Shuttle Box ved å endre en 30,5 x 19 x 7,5 centimeter gelboks med en 5 x 19 centimeter stykke akvarium-klasse plexiglass lagt til hver side i en 45 graders vinkel.

Lag deretter en linje som markerer tankens halvveis for å vurdere når fisken har krysset midten av tanken. Etter å ha tilsøkt 800 milliliter systemvann til Shuttle Box, plasser to til tre fisk i en lagertank som inneholder systemvann. La tanken stå i det mørke rommet der Shuttle Box Assay skal utføres.

Deretter, i det mørke rommet, plasser en fisk i midten av Shuttle Box. Fest lokket og fest elektrodene til en strømforsyning. Fisken skal akklimatiseres i mørket.

Slå av alle lysene og akklimatisere fisken til Shuttle Box i 15 minutter. Vellykket akklimatisering kan vurderes når fisken fritt utforsker tanken. Etter vellykket akklimatisering av fisken, skinner manuelt en 800 lumen rød linse lommelykt omtrent to centimeter fra gelboksveggen på siden okkupert av fisken.

Ikke start en prøve hvis fisken hviler ved siden av platinatråden. Skinn lys stimulansen direkte på fisken og følg manuelt enhver lateral bevegelse av fisken med lyset for å sikre kontinuerlig visualisering av stimulansen. Fortsett å gi lys stimulansen til en av følgende betingelser for en vellykket eller mislykket prøveperiode er oppfylt.

Vurder studien vellykket hvis fisken krysser over tankens halvveis punkt innen 15 sekunder etter lyseksponering. Når fisken krysser halvveis, stopp lys stimulansen umiddelbart. Hvis studien mislyktes, bruk en elektroforese strømforsyning for å påføre en negativ støt stimulus på 20 millivolt til en ampere, vekslende to sekunder på, to sekunder av i 15 sekunder med maksimalt fire støt eller til fisken passerer halvveis i boksen.

Avslutt deretter både lys og negativ stimulans. Før treningsperioden, sørg for en vellykket akklimatisering til Shuttle Box ved å forlate fisken under mørke forhold i 15 minutter. Deretter skinner manuelt en 800 lumen rød linse lommelykt omtrent to centimeter fra gelboksveggen på siden okkupert av fisken.

Skinn lys stimulansen direkte på fisken og følg enhver lateral bevegelse av fisken med lyset for å sikre kontinuerlig visualisering av stimulansen. Mens lyset skinner på fisken, bruk samtidig den ugunstige støtanmulansen på 20 millivolt til en ampere, vekslende to sekunder på, to sekunder av i 15 sekunder med maksimalt fire støt eller til fisken passerer halvveis i esken. Når dette er oppnådd, avslutt lyset og negativ stimulans.

Gjenta for 25 gjentakelser. Etter ferdigstillelse, la fisken en annen akklimatiseringsperiode på 15 minutter under mørke forhold. I løpet av den første testperioden, utfør en vellykket akklimatisering i Shuttle Box i 15 minutter, bruk deretter bare lys stimulansen i opptil 15 sekunder og registrer svarene.

Tenk på studien vellykket hvis fisken krysser over halvveis i Shuttle Box innen 15 sekunder etter å ha startet lys stimulansen og stoppe lys stimulans umiddelbart når fisken krysser halvveis. Se på studien som mislykket hvis fisken ikke krysser halvveis i Shuttle Box 15 sekunder etter å ha startet lys stimulansen og stoppe lys stimulansen etter 15 sekunder. Under den første testingen må du ikke bruke en negativ stimulus etter et mislykket forsøk.

Utfør kortsiktig minnetesting umiddelbart etter den første testperioden. Induser dramatisk hjerneskade og vent i en periode på fire timer før testing. Akklimatisere fisken i Shuttle Box i 15 minutter.

Vurder korttidshukommelse ved å bruke bare lysdemulansen i opptil 15 sekunder og registrer om fisken krysser over halvveis i esken før lyset slås av, betraktes som bestått prøve, eller unnlater å krysse halvveis i løpet av de 15 sekundene som anses som mislykket prøve. Gjenta trinnet ovenfor 25 ganger med en hvileperiode på 30 sekunder mellom hver prøveversjon og registrer antall vellykkede og mislykkede forsøk. Utfør langvarig minnetesting fire dager etter første testing.

Induser traumatisk hjerneskade og vent i en periode på fire timer før testing, og akklimatisere fisken i Shuttle Box i 15 minutter. Vurder langtidshukommelse ved å bruke bare lysremulansen i opptil 15 sekunder og registrer om fisken krysser over halvveis i esken før lyset slås av, betraktes som bestått prøve, eller ikke klarer å krysse halvveis i løpet av de 15 sekundene som anses som mislykket prøve. Gjenta ovennevnte 25 ganger med en 30-sekunders hvileperiode mellom hver prøve og registrer antall vellykkede og mislykkede forsøk.

Instruksjonsoversikten over lærings- og hukommelsesparadigmer for kognitiv vurdering vises her. Den uskadede fisken på åtte måneder, ung voksen, 18 måneder, middelaldrende voksen og 24 måneder, eldre voksen, krevde et lignende antall forsøk for å lære oppførselen til å unngå det røde lyset. Etter å ha brukt den alvorlige stumpe krafttraumatiske hjerneskademodellen, eller STBI, krevde fisken i forskjellige aldre et lignende antall studier for å mestre analysen over en til fem dager etter skade.

På dag én etter STBI krevde fisk i alle aldre et lignende antall studier for å lære oppførselen, som var betydelig større enn de uskadede kontrollene. Den uskadede fisken mestret raskt Shuttle Box, og oppnådde fem påfølgende positive studier i omtrent 17 studier, mens en dag etter en mild hjerneskade, eller en mild TBI, viser fisk en betydelig økning i antall forsøk for å lære oppførselen. Dette underskuddet økte etter to milde TBI og ble ytterligere forhøyet etter tre milde TBI-skader.

Uskadet fisk viser en liten økning i prosentforskjellen av vellykkede forsøk i umiddelbar hukommelse og forsinket minne i forhold til den første testperioden. Etter en enkelt mild TBI viste fisk betydelige og umiddelbare hukommelsesunderskudd sammenlignet med uskadet fisk. Denne trenden fortsatte med gjentatte skader med økende underskudd etter både to milde TBI og tre milde TBI.

Tidspunktet for anvendte bivirkninger er kritisk. Parring av ugunstige stimuli med lyset og deres samtidige fjerning styrker deres tilknytning og er avgjørende for paradigmet. Analysen gir mulighet for rask vurdering eller kompleks assosiativ læring som kan brukes til å undersøke utviklings-, aldrings- og miljøpåvirkninger på kognitiv svikt.