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使用杆状病毒-昆虫细胞培养系统生产和纯化腺相关病毒（AAV）2载体的工艺开发

该协议对于想要使用杆状病毒 – 昆虫细胞培养系统开发AAV生产和纯化方法的研究人员非常有用。使用杆状病毒-昆虫细胞培养系统生产AAV是一种具有成本效益的方法，易于放大，并且与当前的良好生产规范兼容。该协议的某些部分将由我实验室的研究助理Alan Heizer演示。

首先解冻一小瓶Sf9细胞，并立即将它们接种在15毫升昆虫细胞培养基中。在轨道振荡器培养箱中以125 RPM和28摄氏度在圆底烧瓶中以松散的盖子培养Sf9细胞，用于交换空气。在含有200毫升培养基的一升烧瓶中繁殖细胞，以获得足够的细胞用于TIPS细胞生产。

在两个烧瓶中，以2倍10向每毫升第6个功率电池添加50毫升Sf9细胞。用0.5毫升杆状病毒-AAV2-GFP感染一个Sf9细胞瓶，用0.5毫升杆状病毒-AAV2-rep-cap感染另一个烧瓶细胞。三天后，收获一小块等分试样的杆状病毒感染的Sf9细胞，也称为TIPS细胞。

用0.5微克小鼠抗杆状病毒gp64抗体在100微升封闭缓冲液中在100微升封闭缓冲液中在黑暗的环境温度下染色2次10至5次方的未感染和杆状病毒感染的Sf9细胞。用PBS洗涤细胞以除去抗体后，将染色的细胞重新悬浮在含有0.5牛血清白蛋白的300微升PBS中。使用流式细胞术分析细胞上的杆状病毒gp64表达。

当细胞存活80%至90%时，随着直径的增加，收获细胞并在一毫升昆虫培养基中冷冻保存1倍10至7个功率细胞，在负80摄氏度的慢速冷冻容器中用10%胎牛血清和10%二甲基亚砜代替。第二天，将含有TIPS细胞的管转移到液氮冰箱中长期储存。在含有400毫升昆虫细胞培养基的两升烧瓶中，在腺相关病毒或AAV生产所需的振荡器培养箱中，以2倍10至每毫升28摄氏度培养至第6个功率电池，培养并培养幼稚的Sf9细胞。

三到四天后，细胞密度增加到每毫升10到第6次方电池的5至6倍。对于在轨道振荡器培养箱中的烧瓶中生产AAV，请使用移液器或蠕动泵以每毫升10至第6个功率细胞的2倍将400毫升Sf9培养物无菌地接种到两升烧瓶中。将轨道振动器设置为125 RPM和28摄氏度。

解冻每个杆状病毒-AAV-GFP和杆状病毒-AAV-rep-cap TIPS细胞的一小瓶。用20毫升昆虫培养基稀释细胞，并使用台盼蓝对细胞进行活力计数。相对于在摇瓶或生物反应器中培养的幼稚Sf9细胞，以1比10， 000的比例接种两个TIPS细胞。

第二天，无菌收获一毫升Sf9培养物，并用台盼蓝染料染色，以分析细胞计数，活力和形态。在第三天，重复第二天执行的步骤，并在染色Sf9细胞后检查杆状病毒感染的状态。在第五天，重复第二天执行的步骤，然后在Sf9活力降至50%左右时收获培养基和细胞旋转后收集上清液和细胞沉淀，并将其储存在负80摄氏度。

一旦AAV生产者细胞沉淀解冻，加入细胞裂解缓冲液并剧烈混合。在环境温度下孵育重新悬浮的沉淀30分钟以释放AAV颗粒。离心后，将细胞裂解物转移到新容器中。

解冻后混合细胞裂解物和细胞培养物上清液。向细胞裂解物中每毫升20单位的核酸酶和10毫摩尔氯化镁以消化DNA和RNA，并在37摄氏度下孵育2至4小时。使用泵通过0.8微米和0.2微米聚醚砜双过滤系统过滤裂解物。

将澄清的细胞裂解物储存在四摄氏度下过夜，或立即纯化AAV。将10毫升AVB Sepharose柱安装到色谱机上，并将管道插入AAV样品，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中。将管插入色谱机的馏分收集槽中，以收集含有AAV颗粒的柱直通溶液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液的馏分。

以每分钟5毫升的流速将AVB Sepharose柱与五列体积的PBS平衡。使用配备样品泵的色谱机将含有AAV颗粒的过滤细胞裂解物加载到AVB Sepharose亲和柱上。以每分钟3毫升的流速运行样品。

以每分钟3毫升的流速运行PBS，直到280纳米处的紫外线吸光度曲线返回基线并变得稳定。用50毫摩尔柠檬酸钠缓冲液pH 3以每分钟3毫升的流速洗脱AVB Sepharose柱中的AAV颗粒。立即用五分之一体积的500毫摩尔Tris HCl pH 8.0稀释AAV上清液，以中和含有AAV的酸性洗脱缓冲液。

这可以防止酸性pH 3.0洗脱缓冲液可能发生的pH介导的降解。然后用PBS将AAV上清液稀释十倍，使AAV颗粒在生理缓冲液中。储存每列跑过样品的一毫升，洗涤缓冲液和100微升洗脱的AAV上清液，以评估靶细胞感染引起的AAV的存在。

设置切向流过滤系统，配备具有100千道尔顿分子量截止值的聚醚砜膜盒以浓缩AAV。运行200毫升PBS10分钟，以平衡切向流过滤模块。通过控制泵的流量来加载AAV样品，直到样品减少到所需的体积。

用100毫升PBS透析滞留物。将AAV样品浓缩至所需体积后，收集AAV样品，通过0.2微米聚醚砜过滤器过滤，并等分。然后将AAV样品储存在负80摄氏度。

由于多轮感染，大多数Sf9细胞在三到四天内感染杆状病毒，杆状病毒糖蛋白gp64表达证明。大多数细胞也显示出直径的增加。细胞的直径增加，细胞病变效应，大约一半的细胞在感染后五天内死亡，这是AAV生产完成的迹象。

在用对应于AAV级分的酸性缓冲液洗脱时观察到蛋白质的峰值。纯化的AAV样品在SDS-PAGE和银染色后显示出三种不同的衣壳蛋白：VP1，VP2和VP3。最关键的步骤是在冷冻保存之前收获TIPS细胞，当大多数细胞感染杆状病毒时，细胞死亡次数最少。

我们在这里描述了血清型2的AAV载体的生产和纯化作为模型。然而，该协议也可以应用于其他AAV血清型。