Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Processutveckling för produktion och rening av Adeno-associerat virus (AAV)2 Vektor med baculovirus-insektscellskultursystem
Chapters
Summary January 13th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
I detta protokoll produceras AAV2 vektor genom samodling Spodoptera frugiperda (Sf9) insektsceller med baculovirus (BV)-AAV2-grönt fluorescerande protein (GFP) eller terapeutisk gen och BV-AAV2-rep-cap infekterade Sf9 celler i suspension kultur. AAV-partiklar frigörs från cellerna med tvättmedel, förtydligas, renas genom affinitetskolonnkromatografi och koncentreras genom tangentiell flödesfiltrering.
Transcript
Detta protokoll kommer att vara användbart för de utredare som vill utveckla metoder för AAV-produktion och rening med hjälp av baculovirus-insektscellsodlingssystemet. AAV-produktion med hjälp av baculovirus-insektscellsodlingssystem är en kostnadseffektiv metod som är lätt att skala upp och är kompatibel med nuvarande goda tillverkningssed. Vissa delar av protokollet kommer att demonstreras av Alan Heizer, en forskningsassistent vid mitt laboratorium.
Börja med att tina en flaska Sf9-celler och omedelbart så dem i 15 milliliter insektscellsodlingsmedium. Odla Sf9-celler i en orbital shakerinkubator vid 125 RPM och 28 grader Celsius i rundbottnade flaskor med ett löst fäst lock för utbyte av luft. Sprid cellerna i en enliterskolv som innehåller 200 milliliter medium för att få tillräckligt med celler för TIPS-cellproduktion.
Tillsätt 50 milliliter Sf9-celler vid 2 gånger 10 till de 6: e kraftcellerna per milliliter i två flaskor. Infektera en kolv Sf9-celler med 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-GFP och den andra cellkolven med 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-rep-cap. Tre dagar senare skörda en liten alikvot av baculovirus-infekterade Sf9-celler, även kända som TIPS-celler.
Fläcka 2 gånger 10 till den 5: e kraften hos både oinfekterade och baculovirusinfekterade Sf9-celler med 0,5 mikrogram mus anti-baculovirus gp64 antikropp som innehåller ett fluorescerande färgämne i 100 mikroliter av blockerande buffert i 30 minuter vid omgivningstemperatur i mörkret. Efter att ha tvättat cellerna med PBS för att avlägsna antikroppen, suspendera de färgade cellerna i 300 mikroliter PBS innehållande 0, 5 nötkreatur serumalbumin. Analysera baculovirus gp64-uttrycket på celler med hjälp av flödescytometri.
När cellerna är 80 till 90%livskraftiga, med en ökning av diametern, skörda cellerna och kryopreserven 1 gånger 10 till de 7: e kraftcellerna i en milliliter insektsodlingsmedium, ersatt med 10% fetalt bovint serum och 10% dimetylsulfoxid i en långsamt frysande behållare vid negativa 80 grader Celsius. Nästa dag överför du röret som innehåller TIPS-celler till en flytande kvävefrys för långtidsförvaring. Odla och odla naiva Sf9-celler vid 2 gånger 10 till den 6: e kraftcellen per milliliter vid 28 grader Celsius i flera tvålitskolvar som innehåller 400 milliliter insektscellsodlingsmedium i en skakinkubator som behövs för adeno-associerade virus eller AAV-produktion.
Efter tre till fyra dagar ökas celltätheten till upp till 5 till 6 gånger 10 till de 6: e kraftcellerna per milliliter. För AAV-produktion i flaskor i en orbital shakerinkubator, använd en pipett eller en peristaltisk pump för att så 400 milliliter Sf9-odling till 2 gånger 10 till 6: e kraftceller per milliliter till en tvåliterskolv, aseptiskt. Ställ in orbital shaker vid 125 RPM och 28 grader Celsius.
Tina en flaska av varje baculovirus-AAV-GFP och baculovirus-AAV-rep-cap TIPS celler. Späd cellerna med 20 milliliter insektsodlingsmedium och utför ett livskraftantal av cellerna med trypanblått. Inokulera båda TIPS-cellerna i ett förhållande av 1 till 10 000 i förhållande till de naiva Sf9-celler som odlas i en shakerkolv eller bioreaktor.
På dag två, skörda en milliliter av Sf9 kultur aseptically, och fläcka med trypan blå färgämnet för att analysera cellantal, livskraft och morfologi. På dag tre upprepar du stegen som utförs på dag två och kontrollera statusen för baculovirusinfektionen efter färgning av Sf9-cellerna. På dag fem, upprepa stegen som utförs på den andra dagen och skörda sedan odlingsmediet och cellerna när Sf9-livskraften har minskat till cirka 50%Samla supernatanten och cellpelleten efter spinning och lagra dem på negativa 80 grader Celsius.
När AAV-producentens cellpellet tinas, tillsätt celllysbuffert till den och blanda kraftigt. Inkubera den igen suspenderade pelleten i 30 minuter vid omgivningstemperatur för att frigöra AAV-partiklarna. Efter centrifugering överför du cellens lysate till en ny behållare.
Blanda celllyte och cellkultur supernatant efter upptining. Tillsätt 20 enheter per milliliter nukleas och 10-millimolar magnesiumklorid till celllylystern för att smälta DNA och RNA och inkubera i två till fyra timmar vid 37 grader Celsius. Filtrera lysat genom ett 0,8 mikrometer och 0,2 mikrometer polyetersulfonsystem med hjälp av en pump.
Förvara den klarnade cell lysat vid fyra grader Celsius över natten, eller rena AAV omedelbart. Montera en 10-milliliter AVB Sepharose-kolonn på kromatografimaskinen och sätt in rörledningen i AAV-provet, tvättbufferten och elutionsbufferten. Sätt in rör i fraktionsuppsamlarspåren i kromatografimaskinen för att samla in fraktionerna av kolonngenomströmningslösning, tvättbuffert och elutionsbuffert som innehåller AAV-partiklarna.
Balansera AVB Sepharose-kolonnen med fem kolonnvolymer PBS med en flödeshastighet på fem milliliter per minut. Ladda den filtrerade cell lysat som innehåller AAV-partiklar på AVB Sepharose affinitetskolonn med hjälp av kromatografimaskinen utrustad med en provpump. Kör provet med en flödeshastighet på tre milliliter per minut.
Kör PBS genom kolonnen med en flödeshastighet på tre milliliter per minut tills den ultravioletta absorbanskurvan vid 280 nanometer återgår till baslinjen och blir stabil. Elute AAV partiklarna från AVB Sepharose kolonnen med 50-millimolar natriumcitrat buffert pH 3 med en flödeshastighet på tre milliliter per minut. Späd omedelbart ut AAV-supernatanten med en femtedels volym 500 millimoler Tris HCl pH 8,0 för att neutralisera den sura elutionsbufferten som innehåller AAV.
Detta förhindrar den pH-medierade nedbrytning som kan uppstå med surt pH 3,0 elutionsbuffert. Späd sedan ut AAV-supernatanten tiofaldigt med PBS, så att AAV-partiklarna är i en fysiologisk buffert. Förvara en milliliter av varje kolonn genomgående prover, tvättbuffert och 100 mikroliter av den eltuterade AAV-supernatanten för att utvärdera förekomsten av AAV genom infektion i målcellerna.
Ställ in tangentiellt flödesfiltreringssystem, utrustat med en polyetersulfonmembranpatron med en 100-kilodalton molekylviktsavstängning för att koncentrera AAV. Kör 200 milliliter PBS i 10 minuter för att balansera tangentiell flödesfiltreringsmodul. Ladda AAV-provet genom att styra pumpens flöde tills provet reduceras till önskad volym.
Diafiltrera retentatet med 100 milliliter PBS. När AAV-provet har koncentrerats till önskad volym samlar du upp AAV-provet, filtrerar det genom ett 0,2 mikrometer polyetersulfonfilter och alikvoterar det. Förvara sedan AAV-provet på minus 80 grader Celsius.
De flesta av Sf9 cellerna blev smittade med baculovirus i tre till fyra dagar, på grund av att flera omgångar av infektion, framgår av baculovirus glykoprotein gp64 uttryck. De flesta av cellerna visar också en ökning av diametern. Cellerna visar en ökning av diameter, cytopatisk effekt, och ungefär hälften av cellerna dör i fem dagar efter infektion, vilket är tecken på slutförande av AAV-produktionen.
En topp av protein sågs medan elution med en sur buffert motsvarande AAV fraktionen. De renade AAV-proverna visar tre distinkta kapsidproteiner: VP1, VP2 och VP3, efter SDS-PAGE och silverfärgning. Det mest kritiska steget är att skörda TIPS-cellerna före kryopreservation, när de flesta cellerna blir infekterade med baculoviruset, med ett minsta antal celldöd.
Vi har beskrivit produktion och rening av AAV vektor av serotyp 2 som en modell här. Protokollet kan dock också tillämpas för andra AAV-serotyper.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
