Direkte stokastisk optisk rekonstruktion Mikroskopi af ekstracellulære vesikler i tre dimensioner

Denne protokol anvender mikroskopi i superopløsning, specifikt direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi, også kendt som dSTORM, til at omgå diffraktionsgrænsen og visualisere elbiler med nanometerpræcision i tre dimensioner. En bemærkelsesværdig fordel ved dSTORM er dens evne til direkte at visualisere partikler under diffraktionsniveauet af lys uden skadelige trin, der ændrer ev’ens biokemiske karakter. Mange evolutionært forskellige vira anvender EV signalering, derfor dSTORM kan anvendes til at karakterisere elbiler for sygdom biomarkører og progression, samt at visualisere individuelle viruspartikler, såsom SARS-CoV2. Begynd med at placere affinitetsrensede, ekstracellulære vesikler eller elbiler på glasbund, mikroskred, otte-brøndsplader i et samlet volumen på 200 mikroliter, og lad dem klæbe til overfladen natten over ved fire grader Celsius.

Uden at fjerne den eksisterende opløsning fra otte-brøndspladen skal du fastgøre elbiler på pladerne ved at tilsætte 200 mikroliter af 4% paraformaldehyd i 1X PBS til den EV-holdige opløsning i hver brønd og lade pladerne inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt paraformaldehyd og overskydende opløsning med en mikropipette for ikke at forstyrre elbilerne. Vask EV med 1X PBS for at fjerne overskydende paraformaldehyd.

Udfør vaskeproceduren tre gange. Fjern overskydende 1X PBS. Klargør 250 mikroliter dSTORM Bcubed bufferopløsning pr. prøve ved at skabe en opløsning af fem millimolar protocatechuic dioxygenase fortyndet i billedbuffer i henhold til producentens protokol.

Tilsæt 250 mikroliter af den forberedte buffer til hver såvel som pr. producentens protokol, og inkuber pladerne i 20 minutter ved stuetemperatur før billeddannelse for at skylle oxiderende molekyler. Elbilerne kan visualiseres med det samme eller opbevares ved fire grader Celsius i en uge. For at forberede de perler, der er nødvendige for kalibrering af superopløsningsmikroskopet, fortyndes 100-nanometermikrosfærer til en koncentration på 0,5% i molekylærbiologisk kvalitet vand og pipette 200 mikroliter i hver brønd af en glasbund, mikroslid, otte-brønds plade.

Lad perlerne sætte sig i brøndene i en time ved stuetemperatur. Uden at fjerne den eksisterende opløsning tilsættes 200 mikroliter på 4% paraformaldehyd i PBS til hver brønd til kalibreringsperleopløsningen og gør det muligt at inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt paraformaldehyd med en mikropipette for ikke at forstyrre perlerne, og vask perlerne tre gange med 1X PBS.

Forbered bufferen som beskrevet i manuskriptet. Fjern 1X PBS og tilsæt 250 mikroliter af den forberedte buffer til hver brønd. Lad bufferen sidde i 20 minutter før visualisering.

Brug knappen Tilslut mikroskopet til at oprette forbindelse til 3D-mikroskopet, før du placerer noget på scenen. Tilsæt 100X olie til målet, og læg midten af brønden oven på målet. I indstillingen Indsending skal du tænde for excitationlaserne 473-og 640 nanometer og klikke på Vis.

Uden at aktivere 3D-objektivet kan du se perlerne under indstillingen for fotonmætning ved at klikke på Photon-optællinger i billedvisningsindstillingerne. Indstil de første laserkræfter til 8,4 milliwatt for 473-nanometer laser, og 11,6 milliwatt for 640-nanometer laser. Reducer fokus for laseren til omkring minus 300 nanometer eller brændplan af kalibrering perler til at producere en klar opløsning af de enkelte perler.

Når Z-flyet er fokuseret, yderligere justere laser effekt niveauer til at tage højde for variation i hvert synsfelt. Under instrumentfunktionerne skal du fuldføre kalibrering af 3D-kortlægning og kalibrering af kanalkortlægning for at opnå fejlene på X-, Y- og Z-aksen. Angiv det maksimale antal synsfelter til 20, måltallet for punkter til 4.000, den maksimale afstand mellem kanalerne til 5,0 pixel og udelukkelsesradiusen mellem kanalerne til 10,0 pixel under kalibreringen af kanaltilknytningen.

Sørg for, at kalibreringen giver en pointdækning på mere end 90 % og kortlægningskvalitet, der er god. Gem de givne kalibreringsdata til fremtidige billedopkøb. Tilsæt 100X olie på målet, og læg de forberedte elbiler på mikroskopet.

Uden at aktivere 3D-linsen skal du tænde 640-nanometer excitation laser, og i første omgang hæve den til mellem 1,2 og 12,5 milliwatt, afhængigt af intensiteten af signalet i synsfeltet for at ophidse den røde membran, interskalerende, farvestof-farvede elbiler. Skift visningsmetoden fra fotonmætning til fraktiler under Indstillinger for billedvisning for bedre at kunne visualisere elbilerne. Juster lasereffekten for at minimere støj, samtidig med at signalet maksimeres, og alle andre parametre vedligeholdes.

Juster Z-flyets fokus ved at klikke på ikonet op eller ned på Z-aksen. Indstil eksponeringstiden til 20 millisekunder, rammeoptagelsen til 10.000 billeder og den oprindelige lasereffekt til mellem 1,2 og 12,5 milliwatt, afhængigt af signalets intensitet og synsfelt. Aktiver 3D-objektivet ved hjælp af ikonet, og start købet ved at klikke på knappen Indshentning.

I hele billedopsamlingsprocessen skal du øge lasereffekten med tre trin på 10 hver 1000 ramme eller nok til at opretholde et højt signal-til-støj-forhold. Juster ikke Z-flyet under erhvervelsen. Når billedopsamlingen er overtaget, skal du skifte til visningsvinduet Analyser.

Udfør afdriftskorrektion på det ufiltrerede billede, og aktiver derefter filtre. Juster fotontælling, lokaliseringspræcision, sigmas og rammeindeks, som nævnt i manuskriptet. Overlejre et X- Y, Z-plane-visningsværktøj langs X-aksen af individuelle elbiler fra synsfeltet og eksportere de enkelte csv-filer med photoswitching-hændelser.

Tosect individuelle elbiler på X, Y-akse i et X by Y-visningsfelt ved hjælp af et line histogramværktøj, som fastsnævler hændelser i indstillede afstandsgrupper. Tag billeder af enkelte elbiler og gem dem som tif filer. Opret 3D-videoer af individuelle elbiler ved hjælp af et 3D-visualiseringsværktøj og farve i henhold til placering langs Z-aksen.

Efter kalibreringen af mikroskopet, der producerede en gennemsnitlig fejl på 16 nanometer på X, Y-aksen og 38 nanometer på Z-aksen, blev de rensede U20s-elbiler med succes visualiseret med en opløsning på op til 20 nanometer på X, Y-aksen og 50 nanometer langs Z-aksen. Individuelle elbiler visualiseret gennem dSTORM i 3D photoswitched hele 10,000 ramme eksponering som laser magt blev øget, og var let synlige i den erhvervede billede. Post-erhvervelse billede korrektion i Z-plan, foton tæller, sigmas, og lokalisering præcision af det rekonstruerede billede resulterede i en klar opløsning af EV i 3D.

EV photoswitched i løbet af kun de første 7.000 billeder, som det ses af legenden i øverste højre hjørne. Histogrammet bekræfter, at de fleste photoswitching begivenheder fandt sted inden for en 100-nanometer radius, validere, at den visualiserede EV er en exosome, og at isoleringen af elbiler med en lille diameter var vellykket. Størrelsesfordelingsanalyse udført på andre individuelt sporede elbiler ved hjælp af værktøjet Line Histogram og X, Y, Z-plane View-værktøjet bekræftede, at de fleste photoswitching-hændelser fandt sted inden for en radius af 100 nanometer fra midten.

Fejlen langs Z-aksen blev øget, hvilket gav et aflangt endeligt billede af EV langs den aksiale akse. Photoswitching begivenheder var ikke korreleret med EV størrelse, der viser, at dSTORM-baserede karakterisering kan bruges til små elbiler som exosomer og små, indhyllede vira mindre end 100 nanometer i diameter. Mens du udfører dSTORM er det vigtigt at huske at indstille den oprindelige laser magt meget lav, og langsomt hæve det hele billedet erhvervelse for at forhindre photobleaching.

Siden sin udvikling har dSTORM gjort det muligt for forskere bedre at forstå morfologien af subcellulære strukturer, der tidligere har været umulige at visualisere på grund af diffraktionsgrænsen for typisk lysmikroskopi.