Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi av extracellulära blåsor i tre dimensioner
Chapters
Summary August 26th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) används för att kringgå den typiska diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi och för att visa exosomer på nanometerskalan. Det kan användas i både två och tre dimensioner för att karakterisera exosomer.
Transcript
Detta protokoll använder superupplösningsmikroskopi, särskilt direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi, även känd som dSTORM, för att kringgå diffraktionsgränsen och visualisera EVs med nanometerprecision i tre dimensioner. En anmärkningsvärd fördel med dSTORM är dess förmåga att direkt visualisera partiklar under ljusets diffraktionsnivå utan att skada steg som förändrar EV: s biokemiska natur. Många evolutionärt distinkta virus använder EV-signalering, därför kan dSTORM användas för att karakterisera EVs för sjukdomsbiomarkörer och progression, samt för att visualisera enskilda viruspartiklar, såsom SARS-CoV2. Börja med att placera affinitetsrenade, extracellulära blåsor eller EVs på glasbotten, mikroslide, åtta brunnsplattor i en total volym av 200 mikroliter och låt dem hålla fast vid ytan över natten vid fyra grader Celsius.
Utan att ta bort den befintliga lösningen från åtta-brunnsplattan, fixera EVs på plattorna genom att tillsätta 200 mikroliter av 4% paraformaldehyd i 1X PBS till EV-innehållande lösning i varje brunn och låt plattorna inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort paraformaldehyd och överflödig lösning med en mikropipette för att inte störa EL-fordonen. Tvätta EV med 1X PBS för att avlägsna överskott av paraformaldehyd.
Utför tvättproceduren tre gånger. Ta bort överflödig 1X PBS. Förbered 250 mikroliter dSTORM Bcubed buffertlösning per prov genom att skapa en lösning av fem millimolar protocatechuic dioxygenas utspädd i bildbuffert enligt tillverkarens protokoll.
Tillsätt 250 mikroliter av den beredda bufferten till varje brunn enligt tillverkarens protokoll och inkubera plattorna i 20 minuter vid rumstemperatur innan avbildning för att rensa oxiderande molekyler. EVs kan visualiseras omedelbart eller lagras vid fyra grader Celsius i en vecka. För att förbereda de pärlor som krävs för kalibrering av superupplösningsmikroskopet, späd 100-nanometers mikrosfärer till en koncentration av 0,5% i molekylärbiologiskt vatten och pipetten 200 mikroliter i varje brunn på en glasbotten, mikroslide, åtta brunnsplatta.
Låt pärlorna bosätta sig i brunnarna i en timme vid rumstemperatur. Utan att ta bort den befintliga lösningen, tillsätt 200 mikroliter av 4% paraformaldehyd i PBS till varje brunn till kalibreringspärlalösningen och låt inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort paraformaldehyden med en mikropipette för att inte störa pärlorna och tvätta pärlorna tre gånger med 1X PBS.
Förbered bufferten enligt beskrivningen i manuskriptet. Ta bort 1X PBS och tillsätt 250 mikroliter av den beredda bufferten till varje brunn. Låt bufferten sitta i 20 minuter före visualisering.
Använd knappen Anslut mikroskopet för att ansluta till 3D-mikroskopet innan du placerar något på scenen. Tillsätt 100X olja till målet och placera mitten av brunnen ovanpå målet. Slå på 473- och 640-nanometers excitationslasrarna i inställningen Förvärva och klicka på Visa.
Utan att aktivera 3D-objektivet kan du visa pärlorna under inställningen fotonmättnad genom att klicka på Antal foton i bildvisningsalternativen. Ställ in de ursprungliga laserkrafterna på 8,4 milliwatt för lasern på 473 nanometer och 11,6 milliwatt för lasern på 640 nanometer. Minska laserns fokus till cirka minus 300 nanometer eller kalibreringspärornas brännplan för att ge en tydlig upplösning av de enskilda pärlorna.
När Z-planet är fokuserat justerar du lasereffektnivåerna ytterligare för att ta hänsyn till variationen i varje synfält. Under instrumentfunktionerna slutför du kalibrering av 3D-mappning och kanalmappning för att få felen på X-, Y- och Z-axeln. ange det maximala antalet synfält till 20, målantalet punkter till 4 000, det maximala avståndet mellan kanalerna till 5,0 bildpunkter och uteslutningsradien mellan kanalerna till 10,0 pixlar under kalibrering av kanalmappning.
Se till att kalibreringen ger en punkttäckning på mer än 90 % och kartkvalitet som är bra. Spara givna kalibreringsdata för framtida bildförvärv. Tillsätt 100X olja på målet och placera de förberedda EL:erna på mikroskopet.
Utan att aktivera 3D-objektivet slår du på 640-nanometers excitationslasern och höjer den inledningsvis till mellan 1,2 och 12,5 milliwatt, beroende på signalens intensitet i synfältet för att excitera det röda membranet, intercalating, färgfärgade EVs. Under Alternativen för bildvisning växlar du visningsmetoden från fotonmättnad till percentiler för att bättre visualisera EVs. Justera lasereffekten för att minimera bruset samtidigt som signalen maximeras och alla andra parametrar bibehålls.
Justera Z-planets fokus genom att klicka på upp- eller nedikonen på Z-axeln. Ställ in exponeringstiden på 20 millisekunder, bildrutan fångas upp på 10 000 bildrutor och den ursprungliga lasereffekten till mellan 1,2 och 12,5 milliwatt, beroende på signalens intensitet och synfält. Aktivera 3D-objektivet med ikonen och starta förvärvet genom att klicka på knappen Hämta.
Under hela bildförvärvsprocessen höjer du lasereffekten med tre steg om 10 var 1 000:e bildrutor, eller tillräckligt för att upprätthålla ett högt signal-till-brus-förhållande. Justera inte Z-planet under förvärvet. Efter bildförvärvet växlar du över till visningsfönstret Analysera.
Utför driftkorrigering på den ofiltrerade bilden och aktivera sedan filter. Justera fotonantal, lokaliseringsprecision, sigmas och ramindex, som nämns i manuskriptet. Lägg över ett X-, Y-planvyverktyg längs X-axeln för enskilda EVs från synfältet och exportera de enskilda csv-filerna med fotowitching-händelser.
Dela enskilda EVs på X, Y-axeln i ett X x Y-synfält med hjälp av ett linje histogramverktyg, som fäster fotosamtalshändelser i inställda avståndsgrupper. Ta bilder av enskilda EVs och spara dem som tif-filer. Skapa 3D-videor av enskilda EVs med ett 3D-visualiseringsverktyg och färg enligt placering längs Z-axeln.
Efter kalibreringen av mikroskopet som gav ett genomsnittligt fel på 16 nanometer på X-, Y-axeln och 38 nanometer på Z-axeln visualiserades de rena u20-tals-EVs framgångsrikt med en upplösning på upp till 20 nanometer på X-, Y-axeln och 50 nanometer längs Z-axeln. Enskilda EVs visualiseras genom dSTORM i 3D-bilderwitched under hela 10,000 bildrutan exponering som laser kraften ökade, och var lätt uppenbara i den förvärvade bilden. Efter förvärvet av bildkorrigering i Z-planet, fotonräkningar, sigmas och lokaliseringsprecision av den rekonstruerade bilden resulterade i en tydlig upplösning av EV i 3D.
EV-bilderna var bara under de första 7 000 bildrutorna, vilket legenden såg i det övre högra hörnet. Histogrammet bekräftar att majoriteten av fotowitching händelser inträffade inom en 100-nanometer radie, validerar att den visualiserade EV är en exosome, och att isoleringen av EVs med liten diameter lyckades. Storleksfördelningsanalys utförd på andra individuellt spårade EVs med hjälp av Linje Histogram-verktyget och X, Y, Z-plan View-verktyget bekräftade att de flesta fotowitching händelser inträffade inom en radie av 100 nanometer från mitten.
Felet längs Z-axeln ökades, vilket ger en långsträckt slutlig bild av EV längs axialaxeln. Fotowitching händelser var inte korrelerade med EV storlek, visar att dSTORM-baserade karakterisering kan användas för små EVs som exosomer och små, omslutna virus mindre än 100 nanometer i diameter. När du utför dSTORM är det viktigt att komma ihåg att ställa in den ursprungliga lasereffekten mycket låg och långsamt höja den under hela bildförvärvet för att förhindra fotobleaching.
Sedan dess utveckling har dSTORM gjort det möjligt för forskare att bättre förstå morfologin hos subcellulära strukturer som tidigare har varit omöjliga att visualisera på grund av diffraktionsgränsen för typisk ljusmikroskopi.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
