通过选择性核糖体分析对共翻译相互作用网络进行全局鉴定

共翻译相互作用在针对折叠和组装途径的新生链修饰中起着至关重要的作用。在这里，我们描述了选择性核糖体分析，这是一种在真核生物酿酒酵母模型中直接分析这些相互作用的体内直接分析的方法。选择性核糖体分析是迄今为止唯一以直接方式捕获和表征体内共翻译相互作用的方法。

选择性核糖体分析能够以近密码子分辨率对任何因素和与翻译核糖体的相互作用进行全局分析。首先收集含有所需标记蛋白质的构建酵母细胞。在混合研磨机中以30赫兹进行两次低温研磨，持续两分钟，进行细胞裂解。

在4摄氏度下以30， 000倍G离心两分钟以清除裂解物，并收集上清液。将200微升上清液转移到微量离心管中进行总RNA分析，将700微升上清液转移到微量离心管中以进行免疫纯化。使用10个单位的RNase I在旋转的混合架上以每分钟30旋转的速度以4摄氏度消化先前分离的总RNA样品25分钟。

准备蔗糖垫预混液，如文本手稿中所述。然后，将样品上样到400微升蔗糖垫上，并在245， 000倍G和4摄氏度下离心90分钟。用真空泵快速除去上清液，并用150微升裂解缓冲液覆盖沉淀。

用石蜡包裹固定样品，并以每分钟300转的4摄氏度摇动一小时，重悬沉淀。通过在裂解缓冲液中重悬，用一毫升裂解缓冲液洗涤每样品100至400微升亲和力结合基质三次。然后，用旋转的搅拌架以每分钟30转的速度旋转，温度为4摄氏度，持续5分钟。

通过离心沉淀。丢弃上面的液体并重复此过程三次。将亲和结合基质添加到先前分离的免疫纯化样品中，并使用RNase I.Rotate以每分钟30旋转和4摄氏度的速度用旋转的混合架将其消化25分钟，以将蛋白质结合到亲和基质上。

按照文本手稿中的描述准备洗涤缓冲液预混液。用一毫升洗涤缓冲液洗涤亲和力结合基质约一分钟，在混合架中旋转。接下来，通过在4摄氏度下以3000倍G离心30秒沉淀，并丢弃上层液体。

重复三次。在一毫升洗涤缓冲液中再洗涤两次，每次五分钟，在混合架中旋转。通过离心再次沉淀。

使用50微升微球进行蛋白质洗脱，使用相同量的2X样品缓冲液。离心以沉淀珠子并丢弃上部液体。用700微升的10毫摩尔三元洗脱。

然后，在液氮中冷冻。从液氮中取出样品并储存在零下80摄氏度，用于随后的RNA提取。通过蛋白质印迹或考马斯染色，使用模拟IP在未标记的野生型菌株上使用模拟IP作为与亲和基质的非特异性结合的对照，评估亲和力纯化步骤的成功与每个步骤的等分试样。

亲和纯化后的蛋白质印迹结果证明了标记蛋白表达的成功。使用生物分析仪的结果验证了核糖体保护足迹的分离。在生成用于深度测序和大数据分析的cDNA文库时，循环不足会导致产量低。

然而，由于dNTPs仍然存在，反应继续进行，由于PCR产物启动，产生具有嵌合序列的更长的PCR伪影。通过高灵敏度DNA电泳进一步验证了生成的文库，以实现精确的尺寸分布和定量。针对适配器和条形码对序列库进行了修剪，并将结果读取分为不同的编码序列、内含子和基因间序列组。

这里显示了分析Vma2p与核糖体相关伴侣Ssb1p，Pfk2p和Fas1p的共翻译相互作用的核糖体谱，以及每种亲和纯化的实验方案。与Ssb1，Pfk2p和Fas1p相互作用组相比，沿着总翻译组的开放阅读框架存在核糖体占用。此处显示了 Ssb1p、Pfk2p 和 Fas1p 在开放阅读框架中每个核糖体位置的平均富集。

该方法能够鉴定和表征各种共翻译相互作用，确保功能蛋白质组，以及各种疾病的研究。迄今为止，选择性核糖体分析是唯一可以在体内直接捕获和表征这些相互作用的方法。