Login processing...

Journal / Biochemistry /

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Измерение β окисления жирных кислот в суспензии свежеизолированных гепатоцитов мыши

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Journal (Biochemistry)

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Journal (Biochemistry)

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Click here for the English version

Измерение β окисления жирных кислот в суспензии свежеизолированных гепатоцитов мыши

Article DOI: 10.3791/62904-v • 11:03 min

September 9th, 2021 •

Schuyler D. Vickers*¹, Dominique C. Saporito*¹, Roberta Leonardi¹

¹Department of Biochemistry, School of Medicine, West Virginia University

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

September 9th, 2021

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Окисление жирных кислот β является важным метаболическим путем, ответственным за выработку энергии во многих различных типах клеток, включая гепатоциты. Здесь мы описываем метод измерения β окисления жирных кислот в свежевыделенных первичных гепатоцитах с использованием ¹⁴С-меченой пальмитиновой кислоты.

Transcript

Этот протокол был разработан для обеспечения надежного метода измерения общего бета-окисления митохондриальных и пероксисомальных жирных кислот в первичных гепатоцитах мыши. Использование интактных клеток поддерживает целостность органелл и регуляторные механизмы. Кроме того, анализ свежеизолированных гепатоцитов минимизирует изменения в экспрессии генов по отношению к печени происхождения.

Операция может быть сложной. Вы должны быть уверенными, прилежными и сосредоточенными. Как только каннюляция будет успешной, попробуйте расслабиться, но обратите внимание и следите за качеством перфузии.

Для начала процедуры обильно опрыскайте брюшную полость и грудную клетку обезболенной мыши 70% этанолом. Затем используйте щипцы, чтобы подтянуть кожу и брюшную стенку возле основания живота и разрезать латерально по обе стороны от средней линии и до диафрагмы, чтобы обнажить органы. Обнажите нижнюю полую вену, или IVC, переместив кишечник в правую сторону и осторожно перевернув доли печени вверх.

Вставьте небольшой цилиндрический объект, такой как колпачок иглы, под заднюю часть мыши, чтобы слегка наклонить IVC и облегчить канюляцию. После запуска насоса с буферным насосом на самой низкой скорости вставьте иглу в IVC. Затем перережьте воротную вену, чтобы снять давление и обеспечить дренаж крови и перфузионных буферов.

Перед увеличением расхода до семи мл в минуту. Перфузируйте печень теплым буферным и убедитесь, что линия, вставленная в трубку, содержащую буферную, остается непрерывно погруженной, чтобы избежать введения пузырьков воздуха. Пока происходит перфузия, добавляют 130 микролитров раствора коллагеназы в буфер два и смешивают путем пипетки с серологической пипеткой.

Поскольку объем в трубке, содержащей буфер один, уменьшается примерно до пяти мл, медленно добавляйте пять мл буферных двух в буферный один путем пипетирования на боковой стороне трубки. Повторите добавление дважды, прежде чем добавлять оставшиеся два буфера в трубку. Прекратите перфузию, когда в трубке останется от 5 до 10 мл буферных двух.

Затем иссечь печень и переложить ее в 100-мл культуральную чашку, содержащую 20 мл ледяного буфера два. Под ламинарным капюшоном аккуратно разбейте ткань печени с помощью хирургических ножниц и пинцета. Затем добавьте около 20 мл ледяного буфера M199 в суспензию гепатоцитов и отфильтруйте его через 100-микронный клеточный сетчатый фильтр, используя поршень шприца, чтобы мягко способствовать высвобождению дополнительных гепатоцитов из более крупных кусочков печени.

Промыть чашку для культивирования 100 мл и клеточный фильтр с буфером M199, чтобы собрать клеточную суспензию до тех пор, пока трубка для сбора не заполнится. Затем центрифугируют суспензию при 50 х г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируйте супернатант перед повторным использованием гранулы гепатоцитов в 30 мл холодного M199 путем закручивания.

Повторите стирку один раз. Разморозьте растворы пальмитиновой кислоты и бычьего сывороточного альбумина, или BSA, перед приготовлением субстратной смеси для нескольких реакций. Aliquot 13,5 микролитров раствора BSA на реакцию в микроцентрифужной трубке.

После нагревания трубки до 41 градуса Цельсия добавляют один микролитр раствора пальмитиновой кислоты 200 мМ за реакцию. Энергично вращайте трубку до и во время инкубации при температуре 41 градус Цельсия в течение 20-30 минут, чтобы облегчить образование растворимого комплекса пальмитиновой кислоты-BSA. За это время аликвотирует 133 микролитра 1 М хлорной кислоты, которые будут использоваться для остановки реакций в отдельных 1,5-мл микроцентрифужных пробирках.

Перед началом реакций аликвоту и инкубируют 485,5 микролитров буфера M199 за реакцию в трубку при температуре 37 градусов Цельсия для разбавления полученного радиоактивного комплекса BSA-пальмитиновой кислоты. Далее дозируют 750 микролитров M199 с ингибиторами или без них в отдельные 14-мл трубки с круглым дном в качестве образцов. Во время этапов промывания гепатоцитов, за 10-15 минут до начала реакций, перенесите трубки на встряхивающую водяную баню, установленную на 37 градусов Цельсия со скоростью от 180 до 200 оборотов в минуту.

Если жизнеспособность гепатоцитов составляет не менее 75%, завершают приготовление субстратной смеси путем переноса 0,8 микролитра углерод-14 пальмитиновой кислоты за реакцию в микроцентрифужную трубку, содержащую осветленный раствор BSA-пальмитиновой кислоты. Вихрь перед возвращением трубки на водяную баню при 41 градусе Цельсия. Сразу после окончательной ресуспензии гепатоцитов переведите 750 микролитров суспензии гепатоцитов в каждую из 14-мл круглых нижних трубок на встряхивающей водяной бане с помощью пипетки в один мл и кратковременно вихрьте трубки на низкой скорости перед переносом в инкубатор, ошеломляя каждое добавление на 30 секунд.

Переведите отдельную аликвоту гепатоцитов в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл для вращения при 3000 х г в течение пяти минут. Удалите супернатант перед хранением гранулы при минус 80 градусах Цельсия, чтобы измерить общее количество белка в образце для нормализации результатов. В то время как гепатоциты находятся под предварительной инкубацией при 37 градусах Цельсия, добавьте радиоактивный комплекс BSA-пальмитиновой кислоты в теплую среду, чтобы поддерживать при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к началу реакций.

Чтобы начать реакцию, удалите гепатоциты с водяной бани и добавьте к гепатоцитам 500 микролитров субстратной смеси. Вращайте клетки с низкой скоростью в течение пяти секунд, прежде чем вернуться на водяную баню, чтобы инкубировать в течение 15 минут. Запустите комплекс реакций и немедленно остановитесь, чтобы определить фоновую радиоактивность.

Переложите и отложите дубликаты аликвот от 200 до 250 микролитров оставшейся субстратной смеси в 6-мл сцинтилляционных флаконах для выполнения подсчета. Чтобы остановить реакции, удалите гепатоциты с водяной бани для повторного суспендирования путем вихря с умеренной скоростью, а затем перенесите 400 микролитров суспензии гепатоцитов в микроцентрифужные трубки, содержащие хлорную кислоту. Немедленно закройте и вихрьте трубки, прежде чем повторить последовательность для всех образцов, ошеломляя на 30 секунд.

После раскрутки 1,5 мл микроцентрифужных трубок при 13 000 х г в течение 10 минут переложите 300 микролитров супернатанта в 6-мл сцинтилляционный флакон и добавьте 4 мл сцинтилляционной жидкости для подсчета радиоактивности в образцах и подложки смешивают аликвоты в сцинтилляционном счетчике. В исследовании перфузия печени дала от 30 до 40 миллионов клеток на печень, со средней жизнеспособностью 80% Также было замечено, что снижение концентрации глюкозы в группе натощак не оказало негативного влияния на выход или жизнеспособность гепатоцитов. Суспензию гепатоцитов, выделенную у скармливаемых и голодающих самцов мышей, анализировали на способность к бета-окислению жирных кислот в присутствии и отсутствии этомоксира, мощного ингибитора CPT1 и окисления митохондриальных жирных кислот.

Количество в минуту, или CPM, связанное с фоновой радиоактивностью, варьируется в зависимости от партии пальмитиновой кислоты. Однако CPM по-прежнему был значительно ниже, чем образцы, инкубированные со смесью субстрата. Гепатоциты, выделенные у мышей натощак, показывают устойчивое увеличение скорости бета-окисления как митохондриальных, так и пероксисомальных жирных кислот.

Данные были дополнительно изучены для определения скорости, с которой пальмитиновая кислота окисляется в гепатоцитах, выделенных у сытых и голодающих мышей. Предотвращение попадания пузырьков в линию. Держите иглу устойчивой во время перфузии.

Будьте осторожны при обращении с гепатоцитами. Держите их в подвешенном состоянии при их дозировании. Гепатоциты, выделенные в результате этой процедуры, могут быть использованы в качестве суспензии для анализа других метаболических путей, таких как синтез жирных кислот, или они могут быть покрыты для экспериментов с клеточными культурами.

X

Simple Hit Counter