Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Meting van vetzuur β-oxidatie in een suspensie van vers geïsoleerde muizenhepatocyten
Chapters
Summary September 9th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vetzuur β-oxidatie is een essentiële metabole route die verantwoordelijk is voor het genereren van energie in veel verschillende celtypen, waaronder hepatocyten. Hier beschrijven we een methode om vetzuur β-oxidatie te meten in vers geïsoleerde primaire hepatocyten met behulp van 14C-gelabeld palmitinezuur.
Transcript
Dit protocol is ontwikkeld om een robuuste methode te bieden voor het meten van totale mitochondriale en peroxisomale vetzuur bèta-oxidatie in primaire muizenhepatocyten. Het gebruik van intacte cellen handhaaft de integriteit van organel en de regulerende mechanismen. Bovendien minimaliseert het testen van vers geïsoleerde hepatocyten veranderingen in genexpressie met betrekking tot de lever van herkomst.
De operatie kan een uitdaging zijn. Je moet zelfverzekerd, ijverig en gefocust zijn. Zodra de cannulatie succesvol is, probeer dan te ontspannen, maar let op en controleer de kwaliteit van de perfusie.
Om de procedure te starten, spuit u royaal de buik en borst van de verdoofde muis met 70% ethanol. Gebruik vervolgens de tang om de huid en buikwand in de buurt van de basis van de buik omhoog te trekken en zijdelings aan weerszijden van de middellijn en tot aan het middenrif te snijden om de organen bloot te leggen. Stel de inferieure vena cava, of IVC, bloot door de darmen naar de rechterkant te verplaatsen en de lobben van de lever voorzichtig omhoog te draaien.
Plaats een klein cilindrisch voorwerp, zoals een naalddop, onder de achterkant van de muis om de IVC enigszins te kantelen en de cannulatie te vergemakkelijken. Nadat u de pomp met buffer één op de laagste snelheid hebt gestart, steekt u de naald in het IVC. Snijd vervolgens de poortader om de druk te verlichten en drainage van bloed- en perfusiebuffers mogelijk te maken.
Voordat u het debiet verhoogt tot zeven ml per minuut. Perfuseer de lever met warme buffer één en zorg ervoor dat de lijn die in de buis met buffer één is ingebracht, continu ondergedompeld blijft om te voorkomen dat luchtbellen worden geïntroduceerd. Terwijl perfusie optreedt, voegt u 130 microliter collagenaseoplossing toe om er twee te bufferen en mengt u door te pipetteren met een serologische pipet.
Naarmate het volume in de buis met buffer één afneemt tot ongeveer vijf ml, voegt u langzaam vijf ml buffer twee toe om er één te bufferen door aan de zijkant van de buis te pipetteren. Herhaal de toevoeging tweemaal voordat u de resterende buffer twee aan de buis toevoegt. Stop de perfusie wanneer er ongeveer 5 tot 10 ml buffer twee in de buis achterblijft.
Snijd vervolgens de lever weg en breng deze over in de kweekschaal van 100 ml met 20 ml ijskoude buffer twee. Breek onder de laminaire stromingskap het leverweefsel voorzichtig uit elkaar met een chirurgische schaar en een pincet. Voeg vervolgens ongeveer 20 ml ijskoude M199-buffer toe aan de hepatocytensuspensie en filter deze door een celzeef van 100 micron met behulp van de zuiger van een spuit om de afgifte van extra hepatocyten uit de grotere leverstukken voorzichtig te bevorderen.
Was de kweekschaal van 100 ml en de celzeef met M199-buffer om de celsuspensie op te vangen totdat de opvangbuis vol is. Centrifugeer vervolgens de suspensie bij 50 x g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Aspirateer het supernatant voordat u de hepatocytenkorrel in 30 ml koude M199 resuspendeert door te wervelen.
Herhaal de wasbeurt één keer. Ontdooi het palmitinezuur en runderserumalbumine, of BSA, oplossingen voordat u het substraatmengsel voorbereidt op meerdere reacties. Aliquot 13,5 microliter BSA-oplossing per reactie in een microcentrifugebuis.
Voeg na het verwarmen van de buis tot 41 graden Celsius één microliter van de 200 mM palmitinezuuroplossing per reactie toe. Vortex de buis krachtig voor en tijdens incubatie bij 41 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten om de vorming van het oplosbare palmitinezuur-BSA-complex te vergemakkelijken. Gedurende deze tijd, aliquot 133 microliter van 1 M perchloorzuur die zal worden gebruikt om de reacties te stoppen in afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuizen.
Voordat de reacties worden gestart, aliquot en incubeer 485,5 microliter M199-buffer per reactie in een buis bij 37 graden Celsius om het bereide radioactieve BSA-palmitinezuurcomplex te verdunnen. Doseer vervolgens 750 microliter M199 met of zonder remmers in de afzonderlijke 14 ml ronde bodembuizen als de monsters. Breng tijdens de hepatocytenwasstappen, 10 tot 15 minuten voordat de reacties beginnen, de buizen over naar een schuddend waterbad dat is ingesteld op 37 graden Celsius bij 180 tot 200 rotaties per minuut.
Als de levensvatbaarheid van de hepatocyten ten minste 75% is voltooid, is de bereiding van het substraatmengsel voltooid door 0,8 microliter koolstof-14 palmitinezuur per reactie over te brengen op de microcentrifugebuis die de geklaarde BSA-palmitinezuuroplossing bevat. Vortex voordat de buis terugkeert naar het waterbad bij 41 graden Celsius. Onmiddellijk na de laatste hepatocytenreuspensie brengt u 750 microliter van de hepatocytensuspensie over naar elk van de ronde bodembuizen van 14 ml in het schudwaterbad met behulp van een pipet van één ml en vortex de buizen kort op de lage snelheid voordat u deze overbrengt naar een incubator, waarbij elke toevoeging met 30 seconden wordt gespreid.
Breng een afzonderlijke aliquot hepatocyten over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml om gedurende vijf minuten op 3000 x g te draaien. Verwijder het supernatant voordat u de pellet bij min 80 graden Celsius bewaart om de totale hoeveelheid eiwit in het monster te meten om de resultaten te normaliseren. Terwijl de hepatocyten onder pre-incubatie zijn bij 37 graden Celsius, voegt u het radioactieve BSA-palmitinezuurcomplex toe aan het warme medium om op 37 graden Celsius te blijven totdat u klaar bent om de reacties te starten.
Om de reacties te starten, verwijdert u de hepatocyten uit het waterbad en voegt u 500 microliter van het substraatmengsel toe aan de hepatocyten. Vortex de cellen op een lage snelheid gedurende vijf seconden voordat ze terugkeren naar het waterbad om gedurende 15 minuten te incuberen. Start een reeks reacties en stop onmiddellijk om de achtergrondradioactiviteit te bepalen.
Breng de dubbele aliquots van 200 tot 250 microliter van het overgebleven substraatmengsel over en zet opzij in scintillatieflacons van 6 ml om het tellen uit te voeren. Om de reacties te stoppen, verwijdert u de hepatocyten uit het waterbad om te resuspenderen door met een gematigde snelheid te vortexen en vervolgens 400 microliter van de hepatocytensuspensie over te brengen naar de microcentrifugebuizen die perchloorzuur bevatten. Dop en vortex onmiddellijk de buizen voordat u de reeks herhaalt voor alle monsters, duizelingwekkend met 30 seconden.
Nadat u de microcentrifugebuizen van 1,5 ml gedurende 10 minuten op 13.000 x g hebt laten draaien, brengt u 300 microliter van het supernatant over naar een scintillatieflacon van 6 ml en voegt u 4 ml van de scintillatievloeistof toe om de radioactiviteit in de monsters en de substraatmix aliquots in een scintillatieteller te tellen. In de studie leverde de leverperfusie 30 tot 40 miljoen cellen per lever op, met een gemiddelde levensvatbaarheid van 80% Er werd ook waargenomen dat het verlagen van de glucoseconcentratie in de nuchtere groep geen negatief effect had op de opbrengst of levensvatbaarheid van de hepatocyten. De hepatocytensuspensie, geïsoleerd van gevoede en nuchtere mannelijke muizen, werden getest op vetzuur bèta-oxidatiecapaciteit in de aan- en afwezigheid van etomoxir, een krachtige remmer van CPT1 en mitochondriale vetzuuroxidatie.
De tellingen per minuut, of CPM, geassocieerd met de achtergrondradioactiviteit variëren met de partij palmitinezuur. De CPM was echter nog steeds aanzienlijk lager dan de monsters die met de substraatmix werden geïncubeerd. De hepatocyten geïsoleerd uit de nuchtere muizen vertonen een robuuste toename van de snelheid van zowel mitochondriale als peroxisomale vetzuur bèta-oxidatie.
De gegevens werden verder bestudeerd om de snelheid te bepalen waarmee palmitinezuur wordt geoxideerd in de hepatocyten geïsoleerd uit de gevoede en nuchtere muizen. Voorkom dat bubbels de lijn binnendringen. Houd de naald stabiel tijdens de perfusie.
Wees voorzichtig bij het hanteren van de hepatocyten. Houd ze in suspensie wanneer u ze uitdeelt. De hepatocyten die uit deze procedure worden geïsoleerd, kunnen worden gebruikt als een suspensie om andere metabole routes te testen, zoals vetzuursynthese, of ze kunnen worden gebruikt voor celkweekexperimenten.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
