Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Mätning av fettsyra β-oxidation i en suspension av nyligen isolerade mushepatocyter
Chapters
Summary September 9th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Fettsyra β-oxidation är en viktig metabolisk väg som är ansvarig för att generera energi i många olika celltyper, inklusive hepatocyter. Här beskriver vi en metod för att mäta fettsyra β-oxidation i nyisolerade primära hepatocyter med 14C-märkt palmitinsyra.
Transcript
Detta protokoll utvecklades för att ge en robust metod för mätning av total mitokondriell och peroxisomal fettsyra beta-oxidation i primära mushepatocyter. Användningen av intakta celler upprätthåller organellintegritet och de regleringsmekanismer som finns på plats. Dessutom minimerar analys av nyligen isolerade hepatocyter förändringar i genuttryck med avseende på ursprungslevern.
Operationen kan vara utmanande. Du måste vara självsäker, flitig och fokuserad. När kannuleringen är framgångsrik, försök att slappna av, men var uppmärksam och övervaka kvaliteten på perfusionen.
För att starta proceduren, spraya liberalt buken och bröstet på den bedövade musen med 70% etanol. Använd sedan tången för att dra upp huden och bukväggen nära bukbotten och skär i sidled på vardera sidan av mittlinjen och upp till membranet för att exponera organen. Exponera den underlägsna vena cava, eller IVC, genom att flytta tarmarna till höger sida och försiktigt vända upp leverloberna.
Sätt i ett litet cylindriskt föremål, till exempel ett nålskydd, under musens baksida för att luta IVC något och underlätta kannuleringen. När du har startat pumpen med buffert en med lägsta hastighet, sätt in nålen i IVC. Skär sedan portalvenen för att lindra trycket och tillåta dränering av blod- och perfusionsbuffertar.
Innan du ökar flödeshastigheten till sju ml per minut. Perfuse levern med varm buffert en och se till att linjen som sätts in i röret som innehåller buffert en förblir kontinuerligt nedsänkt för att undvika att införa luftbubblor. Medan perfusion inträffar, tillsätt 130 mikroliter kollagenaslösning för att buffra två och blanda genom pipettering med en serologisk pipett.
När volymen i röret som innehåller buffert minskar man till cirka fem ml, tillsätt långsamt fem ml buffert två för att buffra en genom att pipettera på sidan av röret. Upprepa tillsatsen två gånger innan du tillsätter den återstående bufferttvåan till röret. Stoppa perfusionen när cirka 5 till 10 ml buffert två finns kvar i röret.
Skär sedan levern och överför den till 100 ml odlingsskål som innehåller 20 ml iskall buffert två. Under den laminära flödeshuven, bryt försiktigt levervävnaden isär med kirurgisk sax och pincett. Tillsätt sedan cirka 20 ml iskall M199-buffert till hepatocytsupensionen och filtrera den genom en 100-mikron cellsil med hjälp av kolven i en spruta för att försiktigt främja frisättningen av ytterligare hepatocyter från de större leverbitarna.
Tvätta odlingsskålen på 100 ml och cellsilen med M199-buffert för att samla upp cellsuspensionen tills uppsamlingsröret är fullt. Centrifugera sedan suspensionen vid 50 x g i två minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera supernatanten innan du återsuspar hepatocytpelleten i 30 ml kall M199 genom att virvla.
Upprepa tvätten en gång. Tina palmitinsyran och bovint serumalbumin, eller BSA, lösningar innan substrateblandningen bereds för flera reaktioner. Alikvot 13,5 mikroliter BSA-lösning per reaktion i ett mikrocentrifugrör.
Efter uppvärmning av röret till 41 grader Celsius, tillsätt en mikroliter av 200 mM palmitinsyralösning per reaktion. Virvla röret kraftigt före och under inkubation vid 41 grader Celsius i 20 till 30 minuter för att underlätta bildandet av det lösliga palmitinsyra-BSA-komplexet. Under denna tid alikvoterar 133 mikroliter av 1 M perklorsyra som kommer att användas för att stoppa reaktionerna i separata 1,5 ml mikrocentrifugrör.
Innan reaktionerna påbörjas, alikvotera och inkubera 485,5 mikroliter M199-buffert per reaktion i ett rör vid 37 grader Celsius för att späda det beredda radioaktiva BSA-palmitinsyrakomplexet. Därefter dispenseras 750 mikroliter M199 med eller utan hämmare i de separata 14 ml runda bottenrören som proverna. Under hepatocyttvättstegen, 10 till 15 minuter innan reaktionerna påbörjas, överför rören till ett skakningsvattenbad inställt på 37 grader Celsius vid 180 till 200 rotationer per minut.
Om hepatocyternas livskraft är minst 75% slutför beredningen av substratblandningen genom överföring av 0,8 mikroliter kol-14 palmitinsyra per reaktion till mikrocentrifugröret innehållande den klarade BSA-palmitinsyralösningen. Virvel innan du återför röret till vattenbadet vid 41 grader Celsius. Omedelbart efter den slutliga hepatocytåtersuspensionen överför du 750 mikroliter av hepatocytsuspensionen till vart och ett av de 14 ml runda bottenrören i skakningsvattenbadet med en ml pipett och virvlar rören kort med låg hastighet innan de överförs till en inkubator, förskjuter varje tillsats med 30 sekunder.
Överför en separat alikvot av hepatocyter till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för att snurra vid 3000 x g i fem minuter. Ta bort supernatanten innan du förvarar pelleten vid minus 80 grader Celsius för att mäta den totala mängden protein i provet för att normalisera resultaten. Medan hepatocyterna är under förinkubation vid 37 grader Celsius, tillsätt det radioaktiva BSA-palmitinsyrakomplexet till det varma mediet för att hålla vid 37 grader Celsius tills det är klart att starta reaktionerna.
För att starta reaktionerna, ta bort hepatocyterna från vattenbadet och tillsätt 500 mikroliter av substratblandningen till hepatocyterna. Virvla cellerna med låg hastighet i fem sekunder innan de återgår till vattenbadet för att inkubera i 15 minuter. Starta en uppsättning reaktioner och sluta omedelbart för att bestämma bakgrundsradioaktiviteten.
Överför och lägg de dubbla alikvoterna på 200 till 250 mikroliter av den kvarvarande substratblandningen åt sidan i 6 ml scintillationsflaskor för att utföra räkningen. För att stoppa reaktionerna, ta bort hepatocytocyterna från vattenbadet för att återsuspendera genom virvel med måttlig hastighet och överför sedan 400 mikroliter av hepatocytsuspensionen till mikrocentrifugrören som innehåller perklorsyra. Täck omedelbart och virvla rören innan du upprepar sekvensen för alla prover, svindlande med 30 sekunder.
Efter att ha snurrat ner 1,5 ml mikrocentrifugrören vid 13 000 x g i 10 minuter, överför 300 mikroliter av supernatanten till en 6 ml scintillationsflaska och tillsätt 4 ml av scintillationsvätskan för att räkna radioaktiviteten i proverna och substratblandningen alikvoter i en scintillationsräknare. I studien gav leverperfusionen 30 till 40 miljoner celler per lever, med en genomsnittlig livskraft på 80%Det observerades också att sänkning av glukoskoncentrationen i fastegruppen inte hade någon negativ effekt på hepatocyternas utbyte eller livskraft. Hepatocytsuspensionen, isolerad från matade och fastande hanmöss, analyserades för fettsyrabeta-oxidationskapacitet i närvaro och frånvaro av etomoxir, en potent hämmare av CPT1 och mitokondriell fettsyraoxidation.
Antalet per minut, eller CPM, associerat med bakgrundsradioaktiviteten varierar med satsen palmitinsyra. CPM var dock fortfarande signifikant lägre än de prover som inkuberades med substratblandningen. Hepatocyterna isolerade från de fastande mössen visar en robust ökning av hastigheterna för både mitokondriell och peroxisomal fettsyra beta-oxidation.
Data studerades vidare för att bestämma hastigheten med vilken palmitinsyra oxideras i hepatocyterna isolerade från de matade och fastande mössen. Förhindra att bubblor kommer in i linjen. Håll nålen stadig under perfusionen.
Var försiktig när du hanterar hepatocyterna. Håll dem i suspension när du dispenserar dem. Hepatocyterna isolerade från denna procedur kan användas som en suspension för att analysera andra metaboliska vägar, såsom fettsyrasyntes, eller de kan pläteras för cellodlingsexperiment.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
