Tecniche di preparazione dei tessuti per l'imaging micromografico computerizzato con contrasto di modelli cardiaci di mammiferi di grandi dimensioni con malattia cronica

Questo protocollo fornisce informazioni microstrutturali sulle malattie patologiche strutturali a livello di intero organo utilizzando la tomografia a microcomputer. In questo protocollo, viene implementato un metodo specializzato di preparazione dei tessuti per ottimizzare l’imaging ad alta risoluzione di campioni di cuore intero da modelli di mammiferi di grandi dimensioni traslazionali nell’uomo con miglioramento selettivo del contrasto delle malattie strutturali. La microstruttura cardiaca come la distribuzione della fibrosi e l’organizzazione del miocardio eccitabile è alla base di un ampio spettro di malattie cardiache e pone le basi per l’aritmia pericolosa per la vita.

A dimostrare la procedura sarà Nestor Pallares-Lupon, un postdoc e phD laureato per il mio laboratorio. Per iniziare, preparare una soluzione cardioplegica contenente eparina di sodio e conservare la soluzione a quattro gradi Celsius. Quindi, preparare PBS / EDTA aggiungendo prima EDTA a un litro di acqua distillata per una concentrazione finale di 10 millimolari.

Quindi aumentare e mantenere il pH della soluzione a 12 usando idrossido di sodio per sciogliere l’EDTA. Una volta che l’EDTA è completamente disciolto, abbassare il pH a 7,4 usando acido cloridrico. Quindi aggiungere un sacchetto di alluminio di PBS per ottenere una soluzione molare 0,01 con pH 7,4.

Conservare la soluzione preparata a temperatura ambiente. Infine, preparare una soluzione di mezzo di contrasto PMA all’1% di etanolo aggiungendo 10 grammi di PMA a un litro di etanolo assoluto. Conservare la soluzione preparata a temperatura ambiente.

Preparare un serbatoio da un litro supportato a 80 centimetri sopra una piastra di dissezione e accoppiare un tubo termoplastico a una porta di scarico del serbatoio. Fissare un rubinetto a tre vie al tubo di drenaggio e accoppiare ulteriori tubi termoplastici a ciascuna porta libera sul rubinetto a tre vie. Fissare i rubinetti bidirezionali alle estremità libere del tubo.

Quindi, riempire il serbatoio con la soluzione cardioplegica integrata con eparina. Aprire i rubinetti per consentire alla soluzione cardioplegica di drenare rimuovendo tutte le bolle d’aria. Quindi chiudi i rubinetti bidirezionali.

Dopo aver estratto il cuore da un animale eutanasizzato, metterlo in soluzione cardioplegica fredda conservata sul ghiaccio fino a quando non è pronto per la dissezione. Quindi preparare la cannula per l’osteo coronarico sinistro e destro tagliando cinque centimetri di tubo in PTFE e riscaldando un’estremità posizionando la punta accanto a una fiamma nuda. Una volta che un millimetro della punta inizia a sciogliersi e diventa traslucida, premere la punta contro una superficie dura resistente al calore per modellare una cresta sulla punta della cannula per evitare che la cannula scivoli fuori dai vasi, quindi inserire un centimetro dell’estremità non riscaldata di ciascuna cannula nelle due estremità del tubo di drenaggio del serbatoio di scarico.

Quindi, rimuovere la cannula aortica e localizzare l’osteo sinistro e destro delle arterie coronarie sotto la soluzione cardioplegica fredda. Usando forbici appuntite, separare accuratamente la radice aortica dal tessuto circostante sopra e sotto l’osteo coronarico per consentire la filettatura di una sutura di seta a scartamento zero sotto il vaso coronarico. Quindi aprire i rubinetti bidirezionali e inserire le punte della cannula nell’osteo coronarico.

Con le punte della cannula che si estendono da uno a due centimetri nell’osteo e oltre il posizionamento della sutura, legare la cannula. Quindi, sciacquare il cuore massaggiando delicatamente i ventricoli per 15 minuti fino a quando il cuore non viene ripulito dal sangue. Dopo il risciacquo, chiudere i rubinetti bidirezionali, scollegarli dal rubinetto a tre vie e trasferire il cuore in un contenitore plastico resistente agli agenti chimici da un litro contenente 500 millilitri di soluzione PBS/EDTA.

Ricircolare la soluzione PBS/EDTA nel tubo termoplastico sotto una cappa aspirante utilizzando una pompa peristaltica a due canali. Innescare il tubo della pompa fino a quando il tubo non è privo di bolle d’aria. Quindi esaminare ogni cannula coronarica per ricircolo a temperatura ambiente per due ore a 80 millilitri al minuto.

Dopo essersi assicurati che la cappa aspirante sia operativa, arrestare la pompa, scaricare la soluzione dal contenitore e sostituirla con il 10% di formalina per il fissaggio per un’ora a 80 millilitri al minuto. Esaminare il cuore utilizzando una serie di concentrazioni di etanolo incrementali, a partire dal 20% di etanolo per un minimo di tre ore. Quindi sostituire l’etanolo al 20% con l’etanolo al 30% e perfondere per due ore.

Continuare la perfusione incrementando la concentrazione di etanolo ad ogni iterazione con una perfusione minima di un’ora a ciascuna concentrazione. Per rinforzare il tessuto cardiaco prima dell’essiccazione all’aria, ricircolare una miscela uguale di etanolo e HMDS per 10 minuti seguita da 100% HMDS per altre due ore. Arrestare la pompa di perfusione, quindi scollegare la cannula dal tubo e sospendere il cuore da una sutura aortica all’interno della cappa aspirante.

Far scorrere con attenzione un sacchetto con chiusura a zip sul cuore e chiudere il sigillo del sacchetto sopra la sutura per ridurre l’esposizione del cuore all’aria circolante. Lasciare asciugare il cuore attraverso l’evaporazione per una settimana. Per gli agenti di contrasto a caricamento a diffusione, rimuovere il sacchetto.

Lavare il cuore in etanolo al 100% per 15 minuti con agitazione prima di immergerlo in etanolo al 100% integrato con 1% PMA per 48 ore sotto vuoto, quindi coprire il cuore con un sacchetto con chiusura a zip come dimostrato in precedenza e lasciarlo asciugare. Montare il cuore essiccato all’aria su un apposito portacampioni. Per evitare qualsiasi movimento durante le misurazioni micro TC a raggi X, utilizzare un morsetto ancorato al portacampioni e fissare il cuore tramite l’aorta secca e rigida.

Montare il portacampioni nello scanner micro CT. Quindi, aprire il software e avviare il sistema micro CT a raggi X. Quindi impostare il filtro a raggi X in alluminio su un millimetro.

Tensione sorgente raggi X a 60 kilovolt e corrente a 120 microampere. Inoltre, imposta le dimensioni dell’immagine su 2, 016 per 1. 344 pixel e le dimensioni dei pixel su 20 micrometri. Scout immagini di trasmissione a raggi X lungo la lunghezza del supporto per determinare il campo di imaging complessivo nell’accesso longitudinale del cuore.

Per la scansione, utilizzare un passo di rotazione di 0,18 gradi, una media di fotogrammi di cinque e una rotazione del campione di 180 gradi deselezionando l’opzione per un’acquisizione a 360 gradi. Selezionare la modalità di scansione offset per visualizzare l’intera larghezza del supporto del campione. Dopo la scansione, utilizzare il software per la ricostruzione tomografica di un volume di immagine tridimensionale isotropo.

Nel software di ricognizione finale, utilizzare la correzione degli artefatti correlata all’acquisizione, inclusi gli effetti di tempra del fascio del 10% e la riduzione dell’artefatto dell’anello di otto. Successivamente, utilizzando il software Data Viewer, visualizzare lo stack di dati ricostruito. Orientare digitalmente il campione all’interno dei confini dell’immagine per riallineare i campioni dell’asse lungo e corto con i tre assi principali a del volume dell’immagine.

Infine, ritaglia il volume dell’immagine in tutti e tre gli assi per rimuovere i livelli di sfondo esterni dell’immagine e ridurre al massimo le dimensioni totali dell’immagine. L’imaging della trasmissione a raggi X dei cuori di maiale essiccati all’aria mostra i principali punti di riferimento anatomici tra cui le cavità ventricolari e la parete muscolare. Le ricostruzioni tomografiche di volumi di immagini tridimensionali hanno mostrato una netta separazione tra tessuto e sfondo ai confini epicardici ed endocardici.

La colorazione tricroma di Mason ha mostrato una colorazione positiva al collagene negli strati epiteliale ed endoteliale paravascolarmente nel tessuto sub-epicardico. L’illuminazione del campo luminoso ha mostrato una colorazione più scura nelle strutture collagenose dopo la colorazione pmA, sostenendo l’accumulo preferenziale di PMA. Le immagini fluorescenti colorate di PMA delle sezioni di tessuto ventricolare avevano PMA indotto perdita di fluorescenza nei siti di collagene.

Quando un campione di cuore si è macchiato con un mezzo di contrasto tramite perfusione prima dell’essiccazione all’aria, la ricostruzione dell’immagine ha rivelato una colorazione altamente irregolare all’interno del compartimento miocardico. Inoltre, il tessuto a basso contrasto ha mostrato una scarsa separazione dall’intensità di fondo. L’imaging micro TC di una parte di pecora affetta da infarto miocardico cronico ha rivelato una lesione fibrotica densa centrale circondata da una zona di confine sciolta ed eterogenea.

Le maggiori intensità di segnale dei volumi di immagini ricostruite ai confini del tessuto e alle regioni cicatriziali sono mostrate qui. Gli agenti di contrasto hanno macchiato male il miocardio sano, ma il contrasto micro strutturale è stato mantenuto. Nella zona di confine, il tessuto cicatriziale era intervallato da miocardio sopravvissuto.

La fibrosi densa appariva transmurale ma strutturata indicando variazioni nella composizione. La regione ventricolare sinistra transmurale della preparazione del tessuto colorato con PMA ha mostrato una colorazione selettiva per il collagene e nessuna colorazione nelle regioni del miocardio sopravvissuto. Si raccomandano tempi di perfusione più lunghi utilizzando l’etanolo per garantire il completo scambio del contenuto di acqua del cuore con l’etanolo.

Le interazioni tra HMDS e l’acqua producono calore, che può danneggiare il campione. Un forte vantaggio di questa procedura è la capacità di convalidare l’imaging micro CT utilizzando l’istologia. I campioni essiccati all’aria possono essere incorporati direttamente nella paraffina per la colorazione del sezionamento e l’imaging microscopico.