Registrering av nettverksaktivitet i spinale nociceptive kretser ved bruk av mikroelektrodearrayer

MEA 4-AP spinal skive forberedelse beskrevet for deg gir en plattform for å studere tilkoblingen av dorsale hornkretser og hvordan disse nettverkene samhandler under spinal sensorisk behandling. Metodikken som presenteres gjør det mulig å undersøke dorsal hornkretsaktivitet på et makroskopisk regionalt oppløsningsnivå. Dette preparatet kan brukes som et raskt screeningsverktøy for å vurdere forbindelsens evne til å forstyrre signalering i spinal sensoriske kretser.

Denne metoden bidrar til å bygge bro over gapet i vår forståelse av hvordan aktiviteten til bestemte celletyper og små mikrokretser påvirker store populasjoner av nevroner for senere å forme utgangen av dorsale hornadferdsresponser og til slutt smerteopplevelsen. For å begynne, fyll MEA godt med hesteserum i 30 minutter. Etter å ha fjernet serumet, skyll MEA grundig fem ganger med destillert vann til det destillerte vannet blir ikke-skummende.

Fyll deretter brønnen med kunstig CSF. Etter å ha halshugget den bedøvede musen, fjern huden over bukregionen ved å lage et lite kutt i huden på hoftenivået. Trekk deretter huden på hver side av kuttet rostralt til all huden er fjernet fra toppen av ribbe buret til toppen av bekkenet, både ventralt og dorsalt.

Etter å ha plassert kroppen på is, bruk en ventral tilnærming for å eksponere vertebral kolonnen ved å fjerne innvollene og skjære gjennom ribbeina lateralt til brystbenet. Fjern ventral rib buret, både scapulae, og underekstremitetene og bekkenet. Overfør vertebral kolonnen og ribbepreparatet til et dissekeringsbad som inneholder iskald sukrose kunstig CSF.

Fest alle fire hjørner av preparatet ved å plassere pinner gjennom nedre ryggmuskler og de vedlagte øvre ribbeina. Fjern all muskel og bindevev som ligger over den ventrale overflaten av ryggvirvlene med rongeurene og identifiser vertebralområdet over lumbo-sakralforstørrelsen, som ligger omtrent under T12-L2 vertebrale legemer. Fjern en vertebral kropp kaudal til lumbo-sakral utvidelse regionen for å få tilgang til ryggmargen sitter på vertebralkanalen.

Bruk buet fjærsaks, kutt gjennom vertebrale pedikler bilateralt mens du løfter og trekker vertebrallegemet rostralt for å skille de ventrale og dorsale aspektene av ryggvirvlene og eksponere ryggmargen. Når vertebrale legemer er fjernet for å avsløre lumbo-sakral forstørrelse, fjern forsiktig de resterende røttene som forankrer ryggmargen med fjærsaks til ledningen flyter fri. Isoler ryggmargen med rostrale og kaudale kutt over og under lumbo-sakral forstørrelse for å få målområdet i ledningen til å flyte fritt.

For tverrgående skiver, løft og plasser lumbo-sakralsegmentet med en vedlagt rute på en precut polystyrenblokk med en grunne kanal kuttet i midten. Bruk deretter cyanoakrylatlim for å feste blokken og ledningen til seksjonsplattformen og plasser den i skjærebadet som inneholder iskald sukrose kunstig CSF-slurry. Når de 300 mikrometer tykke skivene er oppnådd, overfør skivene til et luftgrensesnitt inkubasjonskammer som inneholder oksygenert kunstig CSF og la skivene balansere i en time ved romtemperatur.

For å begynne å registrere dorsal hornaktivitet, overfør skiven fra inkubatoren til MEA-brønnen ved hjelp av en stor spisspasteurpipette fylt med kunstig CSF og tilsett ekstra kunstig CSF. Bruk en fin, kort hårpensel til å plassere skiven over opptaksmatrisen med 60 elektroder. Deretter legger du en vektet nakke over vevet for å holde det på plass og fremme god kontakt med MEA-elektroder.

Plasser MEA i innspillingshodestadiet. Kontroller vevets posisjon over elektrodene ved hjelp av et omvendt mikroskop for å bekrefte at så mange elektroder som mulig er under overfladisk DH. Forsikre deg om at minst to til seks elektroder ikke kommer i kontakt med skiven. Etter at du har koblet kameraet til enheten, tar du et referansebilde av stykket i forhold til MEA for bruk under analysen.

Trykk deretter på start DAQ i opptaksprogramvaren og bekreft at alle elektroder mottar et klart signal. Fest deretter perfusjonsinnløps- og utløpslinjene til MEA-brønnen fylt med kunstig CSF og slå på perfusjonssystemet. Kontroller strømningshastigheten og sørg for at utstrømningen er tilstrekkelig til å forhindre overløp av superfusatet.

Etter å ha balansert vevet i fem minutter, registrer de rå baselinedataene i fem minutter. Flytt perfusjonsinnløpslinjen fra kunstig CSF til en 4-aminopyridinløsning og vent i 12 minutter på at den 4-aminopyridininduserte rytmiske aktiviteten når steady state. Registrer deretter fem minutter med 4-aminopyridinindusert aktivitet og vær forberedt på de påfølgende opptakene for å teste stoffene eller kontrollere stabiliteten til 4-aminopyridin.

Etter hver innspillingsøkt, skyll linjene med kunstig CSF. Etter å ha fjernet MEA fra hodetrinnet og fjernet nettet og vevet fra MEA-brønnen, skyll MEA og nettet med kunstig CSF og gjenta hele prosessen med en ny skive. Åpne analyseprogramvaren og last inn det forhåndsdefinerte analyseoppsettet.

Åpne interessefilen og fjern merket for referanseelektroden og eventuelle elektroder som anses å være for mye støyende. Angi tidsvinduet for analyse. Gå deretter til filterfanen på tvers av kanaler.

Velg de komplekse referanse- og referanseelektrodene basert på bildet som er tatt og notater gjort under eksperimentet, og trykk på Utforsk før du fortsetter. Gå til EAP-filterfanen og bruk et andre ordre high-pass Butterworth-filter for å fjerne LFP-aktivitet. Gå til LFP-filterfanen og bruk et andre ordrebåndpass Butterworth-filter for å fjerne EAP-aktivitet.

I EAP-detektorfanen må du sørge for å velge automatisk terskel, merke av for stigende og fallende kantbokser og sette dødtiden til tre millisekunder. Hvis du vil angi positive og negative terskler, inspiserer du dataene ved å gå tilbake til rådataanalyseskjermen, flytte tidsmarkøren, gå tilbake til EAP-detektorfanen og trykke på utforsk. Gjenta prosessen til den angitte deteksjonsterskelen fanger opp EAP-er uten å fange opp støy eller ikke-fysiologisk aktivitet.

I LFP-detektorfanen må du sørge for å velge den manuelle terskelen, merke av for boksene for stigende og fallende kanter og sette dødtiden til tre millisekunder. Still inn terskel for en elektrode, og når du er fornøyd, velg Bruk på alle og trykk deretter på startanalyse. Badapplikasjonen av den spenningsstyrte natriumkanalantagonisten tetrodotoksin avskaffet både EAP- og LFP-aktivitet, og bekreftet piggavhengigheten av disse signalene.

Stabiliteten av 4-aminopyridininduserte aktivitetsparametere ble karakterisert for EAP eller LFP. Alle aktivitetskarakteristikker pluss sammenfallet av aktivitet for LFP-er var stabile basert på likheten av 4-aminopyridinindusert aktivitet ved 12 minutter etter 4-aminopyridinpåføring og 15 minutter senere. Funksjonens EAPs eller LFP-er ble preget av en økning i antall sammenfallende hendelser oppdaget på tvers av flere elektroder.

Antall koblede tilstøtende elektroder, og styrken av koblinger mellom tilstøtende elektroder og LFP-er etter 4-aminopyridinstimulering og deretter relativ stabilitet. Skiveretningen er en viktig faktor for in vitro-preparater. 4-aminopyridinstimulering induserte en lignende rytmisk aktivitet i SDH uavhengig av skiveorientering.

Til slutt, for å kaste ytterligere lys over relevansen av 4-aminopyridinaktivering av DH-nettverkene, ble en forhøyet kalium kunstig CSF-løsning påført og vist å fremkalle en lignende DH-respons på 4-aminopyridinstimulering. Viktige trinn i protokollen er i vevsforberedelse og plassering av seksjoner, slik at vevet er sunt gjennom forsiktig, men rettidig, disseksjon, samt delikat optimal plassering av vevet på MEA, vil hjelpe til med å oppnå kvalitetsresultater.