Neuroscience
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使用多重 原位 杂交检测小鼠迷走神经传入神经元中G蛋白偶联受体表达
Chapters
Summary September 20th, 2021
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采用多重 原位 杂交（ISH）来同时可视化成年小鼠整个迷走神经节复合物中两个G蛋白偶联受体和一个转录因子的转录物。该协议可用于生成迷走神经传入神经元转录谱的准确图谱。
Transcript
此过程非常敏感，允许以最少的背景可视化多个成绩单。该方法可以生成高度异质性细胞类型的转录谱的准确图谱。演示该程序的将是我和实验室的研究技术人员Johnson Bob-manuel。
首先从两侧收集八周龄小鼠的整个迷走神经节性肿块，并借助解剖镜和手术器械。斩首小鼠后，使用小镊子去除胸骨，并将胸舌肌侧向气管，以暴露枕骨。清除整个肌肉和组织区域，直到颈动脉，迷走神经和舌下神经和大孔可见。
然后用小弹簧剪刀切开整个舌下神经。将结节定位为靠近大孔的半透明肿块。用小剪刀，小心地折断枕骨。
为了进一步暴露颈静脉神经节，将颈静脉表面的黑色素细胞定位为视觉标志。当发现神经节时，切断迷走神经节肿块之间的神经附件，轻轻拉动迷走神经的外周端，同时用小弹簧剪刀将颈神经节切向脑干，以提取整个神经节肿块。去除粘附在迷走神经上的结膜组织、神经节性肿块和脂肪。
保持迷走神经约半厘米，以方便处理和定位样本。在1.5毫米微型离心管中借助细镊子将去除物置于神经节。并在福尔马林中以4摄氏度孵育24小时。
然后用30%蔗糖24小时。孵育后，将神经节置于一块铝箔上直径为4毫米的最佳切割温度介质内。并在干冰床上表达样品。
用低温恒温器将冷冻样品在零下20摄氏度切割成14微米厚的切片，并将切割的部分收集在玻璃显微镜载玻片上，作为三个系列42微米相隔。用PBS中的组织切片冲洗载玻片。在烤炉中以60摄氏度烘烤30分钟。
然后，将载玻片以4%福尔马林在4摄氏度下后缀15分钟。将载玻片在50%70%和100%乙醇中连续脱水5分钟。并将过氧化氢溶液涂在样品上10分钟，然后在双蒸馏水中冲洗。
对于原位杂交或ISH，用靶向检索试剂处理样品五分钟。然后依次在双蒸馏水和100%乙醇中冲洗样品，然后进行空气干燥。使用疏水笔，在样品周围形成屏障。
当样品在40摄氏度和杂交烤箱下用蛋白酶处理30分钟时，在40摄氏度下预热探针并在使用前在室温下冷却。从烤箱中移出后，在杂交烤箱中将载玻片与所需的目标探针组合在40摄氏度下孵育两小时。用二氢二吡啶甲酸还原酶或DapB孵育阴性对照组织，在40摄氏度下靶向C1探针两小时。
在洗涤缓冲液中冲洗载玻片，并在室温下储存在五次盐水柠檬酸钠中过夜。第二天，用洗涤缓冲液冲洗载玻片，然后用扩增试剂孵育。并按照手稿中所述用通道特异性试剂进行处理。
清洗载玻片，然后用DapB处理30秒。然后立即将安装介质涂抹在每张载玻片上，并在组织切片上放置盖玻片。将组织水平保持在四摄氏度的载玻片架中，直到成像。
通过设置所需的参数准备用于成像的共聚焦显微镜。获取线平均为 4 且像素大小至少为 1024 x 1024 的图像，以提高图像的质量。一旦对采集参数感到满意，请使用相同的设置开始采集图像。
将假颜色归因于每个通道，以便于可视化。使用数字图像，通过识别RNA范围阳性谱的轮廓进行细胞计数，其中一个细胞核用DapB轻轻染色。计算表达每个转录本的RNA范围阳性谱的百分比。
根据在阴性对照组织中获得的非特异性荧光，为每种激光选择最佳采集参数。年轻成年小鼠的结节神经节中的内源性荧光是最小的。并且用DapB探针孵育，它没有产生信号。
在488纳米激光器的功率和增益增加时，会出现不需要的背景和随机荧光点。应用RNA示波器技术检测迷走神经节团组织切片中的三个基因。GHSR 和 CCK1R 的组织谱呈阳性。
该谱包括结节喙部的Phox2b和CCK1R转录本。由于结卵传入神经元中的多重ISH，Phox2b信号特异性地积聚在位于节点神经节中的传入神经元中。CCK1R信号强烈标记了结节中的许多神经元。
在低放大倍率下，表达低CCK1R或GSHR信号的细胞不容易被观察到。DapB有助于可视化组织并识别具有大而轻微染色的细胞核的迷走神经传入神经元。在高放大倍率下，Phox2b阳性轮廓明显。
配置文件二和三是具有高和中度CCK1R信号的Phox2b细胞。概况四表示全球统一制度和CCK1R。由于颈静脉传入神经元的多重性 ISH，可以看到 PRDM12 转录本特异性地积聚在位于颈静脉神经节的传入神经元中。
在高放大倍率下，在配置文件1和2中检测到CCK1R的中等信号。剖面图三是CCK1R或GHSR阴性的PRDM12细胞的代表。解剖的一致性是一个重要因素。
同样重要的是，要验证成像采集参数不会产生不需要的背景信号。多重原位杂交已成为分子建立的黄金标准，特别是在神经解剖学领域。该方法可以很容易地与免疫组化相结合。
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