التقييم الفسيولوجي المرضي للشبكية في نموذج الفئران

الهدف العام من هذه التقنيات هو تقييم الفيزيولوجيا المرضية للشبكية في نموذج اعتلال الشبكية السكري الناجم عن الستربتوزوتوسين. اعتلال الشبكية السكري هو أحد الأسباب الرئيسية للعمى. يستمر البحث المستمر لاكتشاف العوامل الدوائية ذات الفعالية الأفضل والعمل الأطول لعلاج اعتلال الشبكية السكري.

تلعب عملية اكتشاف العوامل الدوائية في النماذج الحيوانية قبل السريرية دورا حيويا. تساعد هذه النماذج الحيوانية على فهم التغيرات الهيكلية والوظيفية لأنسجة الجزء الخلفي من العين. لذلك ، سنعرض ثلاث تقنيات مختلفة لدراسة هذه التغييرات في مشكلات الجزء الخلفي.

نحن نعرض علم الأنسجة لدراسة التغيرات المورفولوجية لخلايا الشبكية في الطبقات ، وفحص انهيار BRB لدراسة BRB المخترق عن طريق تحديد كمية البروتين المتسرب في الجسم الزجاجي من البلازما ، وكذلك تصوير الأوعية الدموية الفلورية لتصور الأوعية الدموية الشبكية باستخدام صبغة FITC-dextran. القتل الرحيم للفئران باستخدام جرعة عالية من البنتوباربيتال وتأكيد وفاته مع عدم وجود نبضات قلب يمكن اكتشافها. استئصال العين عن طريق إجراء شقوق باستخدام شفرة مشرط على المناطق الأنفية والصدغية من العين.

ثم قطع على طول حوافه لإزالة العين من المقبس المداري. إزالة الدهون الزائدة المحيطة بالعين ووضعها في 5 مل من محلول مثبت. احتضان العين في محلول مثبت لمدة 24 إلى 48 ساعة.

بعد التثبيت ، قم بإزالة العين من المحلول المثبت ونقلها إلى طبق بتري مملوء ب 10 مل PBS. باستخدام ملقط صغير ، امسك العين بالعصب البصري واصنع في pars plana بمساعدة مقص صغير. قطع من خلال كامل هامش القرنية لفصل الكوب الأمامي وكوب العين الخلفي.

قم بإزالة العدسة وقطع العصب البصري. قطع الكوب الخلفي إلى نصفين ، مرورا بالعصب البصري. انقل كل نصف إلى أشرطة كاسيت منفصلة.

تجفيف الأنسجة عن طريق زيادة تركيز الإيثانول تدريجيا من 50٪ إلى 100٪ من الإيثانول. وأخيرا ، قم بمسح الإيثانول باستخدام الزيلين. تشريب الأنسجة بالبارافين المسخن مسبقا عند 60 درجة مئوية ليحل محل الزيلين في الأنسجة.

تحضير كتل البارافين باستخدام قالب فولاذي للحفاظ على الأنسجة والكاسيت كقاعدة لها. أثناء تحضير الكتلة ، يجب أن يواجه جزء القرص البصري من العين الجزء السفلي من القالب الفولاذي. املأ الكاسيت بالبارافين وانقله إلى سطح بارد.

قم بتركيب الشفرة والكاسيت على الحاملات المعنية على الميكروتوم. باستخدام ميكروتوم ، قم بتقليم شمع البارافين الزائد وقص شريطا من خمسة إلى ستة أقسام بسماكة 5 ميكرومتر. انقل الشريط إلى سطح الحمام المائي الذي تم تسخينه مسبقا لكشف الشريط.

اجمع الأقسام على شريحة زجاجية مغلفة بالألبومين. اترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. لأداء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين ، قم بتسخين الشرائح مسبقا عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لإذابة البارافين.

اتبع إجراء التلطيخ كما هو موضح في المخطوطة. ابدأ بإماهة الأنسجة ، ثم تلطخ بالهيماتوكسيلين متبوعا باليوسين. الآن ، جفف الأنسجة وأضف وسط التركيب على الأقسام.

ضع زلة الغطاء على الأقسام وتصورها تحت المجهر الضوئي. لإجراء فحص انهيار حاجز الدم والشبكية ، قم بتخدير الفئران باستخدام الكيتامين والزيلازين وتأكيد حالة التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم. حدد موقع القلب وأدخل حقنة 1 مل مع إبرة قياس 24 لسحب الدم عن طريق ثقب القلب.

بمجرد جمع الدم الكافي ، قم بنقله إلى أنبوب مغلف ب EDTA. امزجه بلطف لمنع انحلال الدم. قم بتحريك العين ونقلها على الفور إلى الثلج الجاف.

في ظل الظروف المجمدة ، ابدأ تشريح العين عن طريق إزالة القرنية والعدسة. اسحب الجسم الزجاجي من الجزء الخلفي من العين باستخدام ملقط دون أي تلوث من شبكية العين. نقله إلى أنبوب التجانس مع ثلاثة إلى أربعة خرزات.

تجانس العينات باستخدام مجانس الخرز بسرعة متوسطة لمدة 10 ثوان. نقل عينات الدم والفكاهة الزجاجية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لمزيد من المعالجة. الطرد المركزي لكل من العينات في 5،200 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.

باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 250 ميكرولتر من كاشف برادفورد إلى الآبار. تمييع العينات الزجاجية 10 مرات وعينات البلازما 20 مرة باستخدام PBS. أضف 5 ميكرولترات من العينات المخففة إلى كاشف برادفورد واخلطها جيدا.

احتضن العينات لمدة 20 إلى 30 دقيقة، ثم قم بقياس الامتصاص عند 590 نانومتر باستخدام قارئ صفائح 96 بئرا. كثافة العينة تتناسب طرديا مع تركيز البروتين. لإجراء تصوير الأوعية الفلورية ، قم بتخدير الفئران باستخدام 3٪ isoflurane وتأكيد حالة التخدير عن طريق لكمة إصبع القدم.

اغمس الذيل في الماء الدافئ قبل حقن الصبغة. حقن 1 مل من 50 ملغ لكل مل FITC-dextran محلول في الوريد الذيل الجانبي. اترك الصبغة تدور لمدة 5 إلى 10 دقائق.

القتل الرحيم للفئران باستخدام pentobarbital وتأكيد وفاته عن طريق عدم وجود نبضات قلب يمكن اكتشافها. قم بتحريك العين والمضي قدما في إعداد التثبيت المسطح. لتحضير حامل مسطح للشبكية ، ضع العين على كيمويب خال من الألياف واقطع الجزء الأمامي من العين.

اسحب العدسة ببطء ، إلى جانب الفكاهة الزجاجية ، من الجزء الخلفي من العين. انقل الجزء الخلفي إلى طبق بتري مملوء ب PBS واقطع العصب البصري. الآن ، ضع طرف الملقط المدبب بين الصلبة والشبكية.

حركه برفق على طول حافة الكأس للتأكد من أن شبكية العين غير متصلة بالصلبة في أي وقت. قطع بالقرب من القرص البصري ، بحيث تنفصل شبكية العين تماما عن الصلبة. بمجرد التأكد من أن شبكية العين غير متصلة بالصلبة من أي جانب ، ادفعها ببطء إلى محلول PBS.

بمساعدة ملقط ، انقل شبكية العين إلى شريحة زجاجية نظيفة دون التسبب في أي ضرر لها. باستخدام مقص صغير أو شفرة مشرط ، قم بإجراء أربعة جروح على شبكية العين ، كما هو موضح ، لتقسيمها إلى أربعة أرباع. أزل PBS الزائد من محيط الشبكية وأضف وسط تركيب مضاد للتلاشي على حامل الشبكية المسطح.

قم بتغطيته بغطاء وتصور الحامل المسطح تحت المجهر البؤري. من المهم أن نلاحظ هنا أن العملية الكاملة لتصوير الأوعية الدموية الفلورية يتم إجراؤها تحت الحد الأدنى من الضوء لتجنب إخماد التألق من صبغة FITC-dextran. في الفئران المصابة بالسكري ، تخضع خلايا الشبكية للتنكس ، مما يؤدي إلى مزيد من المضاعفات.

يمكن تصور هذه التعديلات الهيكلية بواسطة تقنية علم الأنسجة لتحديد عدد الخلايا وسماكة شبكية العين. في حالة الفئران المصابة بالسكري ، يزداد سمك طبقات الشبكية بسبب الوذمة. وبالتالي ، تساعد هذه التقنية على فحص مختلف العوامل الدوائية المحتملة لعلاج اعتلال الشبكية السكري.

التغيرات الأيضية في شبكية العين بسبب مرض السكري تسبب فقدان pericytes وانهيار حاجز الدم في شبكية العين. نظرا لوجود تسرب للبروتين والجزيئات الحيوية الأخرى إلى شبكية العين والجسم الزجاجي ، تزداد مستويات البروتين الكلي في الجسم الزجاجي للفئران السكرية. يمكن أن يؤدي منع انهيار الحاجز الدموي الشبكي إلى إعاقة تقدم اعتلال الشبكية السكري بشكل كبير.

في اعتلال الشبكية السكري ، يزيد التعبير عن عامل النمو البطاني الوعائي الذي يؤدي إلى تكوين أوعية جديدة. هذه الأوعية تزعج بنية الشبكية الطبيعية ، وبالتالي فإن تعصيبها هو مصدر قلق أساسي لعلاج اعتلال الشبكية السكري. يتم استخدام تقنية تصوير الأوعية الدموية الفلورية لتصور الأوعية الدموية الجديدة وكذلك تسرب الأوعية الدموية ، كما هو موضح هنا.

ومع ذلك ، فإن تكوين الأوعية الدموية بارز فقط بعد ستة إلى 12 شهرا من تحريض مرض السكري. تساعدنا هذه التقنية على تحديد تأثير العلاج بالعقاقير على تعصيب تولد الأوعية الدموية وتسرب الأوعية الدموية. يحتاج العلاج المستقبلي لاعتلال الشبكية السكري إلى عوامل دوائية أكثر كفاءة ، ولكن لا يمكن تحقيق العلاجات المستقبلية إلا من خلال فهم أفضل للإمراض المرضية.

يمكن أن يساعد إتقان هذه التقنيات الباحثين على الحصول على فهم أفضل حول التسبب في اعتلال الشبكية السكري ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف تدخلات دوائية أفضل.