Denne artikel præsenterer en metode til spatiotemporal analyse af mobile, enkelt-molekyle Förster resonans energioverførsel (smFRET)-baserede sonder ved hjælp af widefield fluorescens mikroskopi. Den nyudviklede software toolkit gør det muligt at afgøre smFRET tidsspor af bevægelige sonder, herunder den korrekte FRET-effektivitet og de molekylære positioner, som tidsfunktioner.