Bioengineering
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Automatisert todimensjonal romlig analyse av mobile ettmolekyls FRET-sonder
Chapters
Summary November 23rd, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikkelen presenterer en metode for romlig analyse av mobil, enkeltmolekyl Förster resonans energioverføring (smFRET)-baserte sonder ved hjelp av widefield fluorescensmikroskopi. Det nyutviklede programvareverktøysettet gjør det mulig å bestemme smFRET-tidsspor for bevegelige sonder, inkludert riktig FRET-effektivitet og molekylære posisjoner, som tidsfunksjoner.
Transcript
Ettmolekyls FRET-eksperimenter ved hjelp av overflatebundne sonder har blitt utført nesten utelukkende på immobiliserte molekyler tidligere. Imidlertid diffuserer mange biomolekyler og kan analyseres med vår metode. Ved å kombinere enkeltmolekylet FRET med sporing er det mulig å analysere ikke bare FRET-mangeltidsspor av bevegelige sonder, men også å undersøke romlige aspekter som diffusjonsadferd.
Vår metode er kompatibel med en rekke forskjellige FRET-baserte sonder. Det kan for eksempel gi innsikt i molekylære krefter, konformasjonsdynamikk og bindende kinetikk i levende celleeksperimenter. Fret-eksperimenter av høy kvalitet er notorisk vanskelige å utføre.
For pålitelig kvantifisering er det viktig å registrere data med et godt signal-til-støy-forhold og enkeltmolekylspor med tilstrekkelig lengde. For å starte prøvemålingen, begeistre donoren og akseptørens fluoroforer i en passende belysningstid mens du utløser kameraet og vent til kameraets avlesning er aktivert. Gjenta eksitasjonen av donor og aksepter fluoroforer alternativt.
Velg antall repetisjoner som skal være store nok til å sikre fotobleking av minst en fluorofor per sonde innen synsfeltet, slik at trinnvis fotobleachinganalyse kan diskriminere enkeltmolekylsignaler fra aggregater. Angi belysningssekvensen for å tillate valg av eksitasjonsrammer for donor og aksepter samt rammer for bildesegmentering fra innspilte bildesekvenser. Analyser datasettene som er registrert ved hjelp av de samme belysningsinnstillingene samtidig.
Til dette formål tilordner du en identifikator og et mønster som samsvarer med de respektive bildesekvensfilnavnene til hvert datasett. I tillegg kan du definere spesifikke datasett for spesielle formål, for eksempel opptak av fiducial markører for bilderegistrering, eksitasjonslysprofiler for flat feltkorrigering, og eventuelt bare donor- og aksepterprøver for å bestemme korrigeringsfaktorer. Deretter velger du utslippskanaler og RAW-bilder hvis begge kanalene er tatt opp med ett enkelt kamera.
For dette, bruk riktig grafisk widget for å velge passende regioner for donor- og akseptutslipp, og deretter lokalisere fiducial markører i begge utslippskanaler og utføre bilderegistrering. Bruk det medfølgende brukergrensesnittet til å finne de riktige parameterne for lokaliseringsalgoritmen for både giver- og akseptutslippskanaler. Deretter angir du lokaliseringsparametere for enkeltmolekyler for FRET-sonder ved donoreksitasjon i summen av bildene hentet fra donor- og akseptorutslipp, og angir deretter lokaliseringsparametere for sonder ved akseptoreksitasjon i akseptorutslippskanalen.
Lokaliser FRET-sondene ved donor og akseptoreksitasjon uavhengig i alle rammer. Resultatene slås sammen til én tabell som inneholder det opprinnelige rammenummeret, todimensjonale koordinater og en identifikator som refererer til kildebildefilen. Hvis du vil spore og måle fluorescensintensitet, velger du passende alternativer for Trackpy-algoritmen for å koble FRET-sondelokaliseringer til baner.
Deretter bruker du analyseprogramvarefunksjonaliteten til å behandle hjelpebildedata fra bildesekvenser. Trekk ut flere bilder som er tatt for å lette segmentering merket med S i eksitasjonssekvensen. Til slutt bestemmer du donor- og akseptoreksitasjonslysprofilene på tvers av synsfeltet fra bilder som er tatt opp på et tett merket utvalg.
For de første filtreringstrinnene, kast signaler med overlappende punktspredningsfunksjoner, da det er vanskelig å bestemme fluorescensintensitetene pålitelig. Ved inhomogen belysning, godta bare signaler som ligger i godt opplyste områder innen synsfeltet for å sikre godt signal-til-støy-forhold. Hvis du studerer intramolekylær FRET, begrense analysen til de banene som er tilstede fra begynnelsen av bildesekvensen.
Deretter utfører du den flate feltkorrigeringen, som bruker eksitasjonslyskildeprofilene som ble oppnådd tidligere for å reversere de posisjonsavhengige fluorescensintensitetsvariasjonene forårsaket av inhomogen belysning, og deretter beregne den tilsynelatende FRET-effektiviteten og den tilsynelatende stoichiometrien. For å utføre trinnvis analyse av fotobleaching for diskriminering mellom enkeltmolekylære sonder og aggregater, finn passende parametere for endringspunktdeteksjonsalgoritmen ved donor og akseptereksitasjon uavhengig. Utfør deretter algoritmen for endringspunktgjenkjenning.
Hvis du vil fjerne spor som viser tvetydig fotobleaching-virkemåte, definerer du intensitetsterskler som en fluorofor anses som bleket under, og deretter velger du ett av følgende alternativer. Alternativ en hvor akseptor fluorophore blekemidler i et enkelt trinn mens donoren viser ingen delvis bleking. Alternativ to der donor blekes i et enkelt trinn mens det ikke er noen delvis akseptorbleking.
Alternativ tre hvor enten fluorofor blekemidler i et enkelt trinn mens den andre ikke delvis blekes. Og alternativ fire der donor og akseptor fluorophores viser enkeltsteg fotobleaching eller ingen fotobleaching i det hele tatt. Beregn deretter korreksjonsfaktorene for donorutslippslekkasje i akseptorkanalen, direkte akseptoreksitasjon, deteksjonseffektivitet og eksitasjonseffektivitet.
Deretter bruker du korreksjonsfaktorene til å beregne FRET-effektivitet fra tilsynelatende effektivitet og stoichiometri fra tilsynelatende støkiometri. Hvis du vil filtrere ytterligere, velger du bare datapunkter fra før den første blekingshendelsen i hver bane. I tillegg, for å begrense analysen til enkeltmolekylsonder, godtar du bare baner med minst 75% av datapunktene innenfor de aktuelle stoichiometrigrensene.
Utfør deretter bildesegmentering via globale eller adaptive terskelmetoder på de aktuelle hjelpebildene for å begrense analysen til forskjellige områder innen synsfeltet. Skap effektivitet kontra stoichiometri tomter for å bekrefte at signaler om feil stoichiometri er riktig identifisert og fjernet. Deretter plott histogrammer av FRET effektivitet for å gi en veletablert oversikt over FRET effektivitet distribusjoner og grupper histogrammer for praktisk sammenligning av resultater fra ulike eksperimenter.
Ved å dra nytte av vitenskapelige Python-biblioteker, er det mulig å evaluere dataene i notatboken ytterligere, og utføre for eksempel diffusjonsanalyse. Visualisering og sporing av en-molekyl FRET hendelse er vist her. Filtrerte FRET-hendelser representeres av effektivitet kontra stoichiometriplott i et FRET-effektivitets histogram.
Videre kan mobilitetsparametere undersøkes ved å plotte en individuell bane i en XY-tomt eller en gjennomsnittlig firkantet forskyvningsplott. Utgangen av plattformen vår gjør det mulig for oss å identifisere overganger ytterligere i FRET effektivitetstid spor av mobile sonder. For eksempel, for å evaluere konformasjonsendringer av biomolekylene.
Ved hjelp av en FRET-basert kraftsensor tillot analyseplattformen oss å kvantifisere enkeltmolekylkrafthendelser i den immunologiske synapsen under tidlig T-cellesignalering.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
