Login processing...

JoVE Journal
Environment

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Environment

Isolering og identifikation af vandbårne antibiotikaresistente bakterier og molekylær karakterisering af deres antibiotikaresistensgener

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Journal (Environment)

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Extracting Metrics for Three-dimensional Root Systems: Volume and Surface Analysis from In-soil X-ray Computed Tomography Data

Journal (Environment)

Extracting Metrics for Three-dimensional Root Systems: Volume and Surface Analysis from In-soil X-ray Computed Tomography Data

Click here for the English version

Isolering og identifikation af vandbårne antibiotikaresistente bakterier og molekylær karakterisering af deres antibiotikaresistensgener

Article DOI: 10.3791/63934-v

March 3rd, 2023 •

Devika Ghadigaonkar¹, Archana Rath¹

¹Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 3rd, 2023

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Her præsenterer vi en detaljeret protokol til isolering og identifikation af antibiotikaresistente bakterier fra vand og molekylær karakterisering af deres antibiotikaresistensgener (ARG'er). Brugen af kulturbaserede og ikke-kulturbaserede (metagenomiske analyser) teknikker giver fuldstændig information om den samlede bakterielle mangfoldighed og den samlede pulje af forskellige ARG'er, der findes i ferskvand fra Mumbai, Indien.

Transcript

Vores metode besvarer centrale spørgsmål, såsom hvad er den samlede belastning af antibiotikaresistente bakterier i vandprøven? Hvad er identiteten af disse bakterier, og hvad er forskellige typer antibiotikaresistente træk og gener, de bærer? Fordelen ved vores protokol er, at den kan detektere selv bakterier, der ikke kan dyrkes i laboratoriet, som udgør en betydelig andel af de samlede bakterier i vandprøven.

Derfor er teoretisk set ingen bakterie eller dens resistente træk udeladt. Denne kombinatoriske teknik, der involverer både kulturbaserede og kulturuafhængige teknikker, kan replikeres og tilpasses til enhver prøve opnået fra spildevand, farmaceutisk eller hospitalsudstrømning, kliniske og ikke-kliniske indstillinger og mere. Sammen med Devika vil Harshali Shinde og Maitri Mishra, begge seniorforsker fra mit laboratorium, demonstrere de eksperimentelle procedurer.

Til at begynde med skal du behandle vandprøven aseptisk ved at filtrere den gennem en steril musselinklud for at fjerne eventuelle partikler. Derefter fortyndes den filtrerede vandprøve serielt til yderligere analyse. For at bestemme den totale bakteriebelastning anbringes 100 mikroliter af de passende fortyndinger af den filtrerede vandprøve på de størknede R2A-agarplader og duplikater og spredes jævnt.

Alle prøvespredningspladerne inkuberes ved 35 til 37 grader Celsius i 48 timer. Efter inkubationsperioden tælles kolonierne og udtrykkes den samlede bakteriebelastning i kolonidannende enheder pr. Milliliter. For at bestemme det antibiotikaresistente bakterietal tilsættes antibiotika separat i rør indeholdende 20 ml sterilt smeltet R2A-agar modificeret ca. 40 grader Celsius.

Hvirvl for at blande jævnt og hæld på sterile petriplader, før agaren størkner. For kvalitetskontrol og for at kontrollere antibiotikas effektivitet spredes 100 mikroliter bakteriel suspension på deres respektive antibiotika indeholdende R2A agarmodificerede plader. Inkuber pladerne ved 35 til 37 grader Celsius i 48 timer, og bestem derefter bakterieantallet.

For at forberede DNA-skabelonen fra isolaterne til PCR ved hjælp af en steril tandstikker, tag en enkelt isoleret ren koloni af isolatet, der vokser på en petriplade. Suspender bakteriekolonien i 100 mikroliter sterilt dobbeltdestilleret vand i et mikrocentrifugerør og kog det i et kogende vandbad eller et tørt bad i 10 minutter ved 100 grader Celsius. Suspensionen centrifugeres ved 10.000 g i to minutter for at pelletere affaldet og overføre supernatanten til et friskt, sterilt mikrocentrifugerør til brug som rå DNA-skabelon.

For at amplificere V3-regionen af 16S rRNA-genet ved PCR fremstilles 40 mikroliter af reaktionsblandingen i et PCR-rør. Placer røret i den termiske blok, og kør det relevante program i PCR termisk cyklist. For at løse og visualisere PCR-amplikonerne blandes 10 mikroliter af det amplificerede PCR-produkt i to mikroliter 6x gelbelastningsbuffer og lægges denne blanding i brøndene i en 1,5% agarosegel sammen med en 100 baseparret DNA-stige til estimering af ampliconsens størrelse.

Udfør elektroforese af gelen i TAE-tankbufferen ved 80 til 100 volt, indtil sporingsfarvestoffet løber 3/4 af gelen. Visualiser derefter amplicon båndene under en UV-transilluminator. For at forberede inokulumet inokuleres aseptisk en enkelt isoleret renset antibiotikaresistenskoloni ved hjælp af en steril sløjfe i to ml Luria-Bertani eller LB, bouillon uden antibiotika og inkuberes ved 37 grader Celsius ved 80 o / min natten over.

Den følgende dag tilsættes 100 til 150 mikroliter af den natten over dyrkede kultur til to ml frisk ikke-selektiv LB-bouillon og inkuberes i to til fire timer, indtil den optiske tæthed ved 600 nanometer når 0,4 til 0,5. Fortynd den friskdyrkede kultursuspension ved hjælp af steril 0,85% saltopløsning og bland forsigtigt for at fordele cellerne jævnt for at nå en kulturtæthed svarende til 0,5 McFarland-standard. Inden for 15 minutter efter fortynding dyppes en steril vatpind i podningen og fjernes overskydende suspension for at undgå overpodning af pladerne.

Spred derefter kulturen jævnt på den forberedte Mueller Hinton agarplade, startende fra toppen og gå frem og tilbage fra kant til kant. Drej derefter pladen med 60 grader, og start podning igen. For at placere antibiotikaskiverne skal du bruge en flammesteriliseret tang og aseptisk overføre antibiotikaskiverne til de podede agarplader.

Tryk forsigtigt på skiverne for at sikre fuldstændig kontakt med agaren. Anbring det passende antal antibiotikaskiver på agarpladen under hensyntagen til organismen, det anvendte antibiotikum og pladestørrelsen for at undgå overlapning af hæmningszonerne. Inden for 15 minutter efter påføring af antibiotikaskiven vendes pladerne og inkuberes ved 37 grader Celsius natten over.

Den følgende dag måles zonen med hæmningsdiameter i millimeter og fortolkes i henhold til brudpunktsværdierne givet af EUCAST. Den samlede bakteriebelastning i vandprøven viste sig at være 3,0 x 10 til den niende CFU / ml, og den antibiotikaresistente bakteriebelastning viste sig at være høj. De sekventerede antibiotikaresistenskulturisolater tilhørte Enterobacteriaceae-familien, hvor de fleste var Escherichia coli og Klebsiella pneumoniae.

Derudover blev sjældne opportunistiske bakterier også identificeret. Antibiotikafølsomhedstestningen ved diskdiffusionsmetode viste et multipelt antibiotikaresistensindeks på ca. 0,2 for otte isolater, hvilket indikerer en høj grad af resistens. Imidlertid viste Comamonas og Arthrobacter arter ikke resistens over for nogen af de testede antibiotika.

De dyrkbare isolater afslørede tilstedeværelsen af antibiotikaresistensgener, der koder for faktorerne mod beta-lactamer, trimethoprim og aminoglycosider. Metagenomisk DNA-analyse for total bakteriel mangfoldighed førte til identifikation af 50 phyla, hvilket indikerer den høje bakterielle mangfoldighed, hvor proteobakterier var den mest dominerende phylum, bestående af klasserne alfaproteobakterier, betaproteobakterier og gammaproteobakterier. På ordreniveau var Burkholderiales den mest udbredte, der tilhørte klassen Betaproteobacteria.

På det generelle niveau var Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium og Comamonas nogle af de rigelige bakterier. Den metagenomiske DNA-analyse afslørede også flere antibiotikaresistensgener. I denne metode er det serielle fortyndingstrin kritisk, da enhver fejl kan føre til en forkert fortolkning af den samlede CFU og den antibiotikaresistente bakteriebelastning.

Desuden skal hæmningszonens diameter måles omhyggeligt for korrekt at fortolke, om isolatet er resistent eller følsomt. Ved hjælp af disse protokoller kan der udover vandprøve undersøges enhver anden prøve, det være sig miljø, mad eller klinisk. Desuden kan andre mikrobielle populationer i ethvert økosystem udover bakterier også studeres ved hjælp af lignende tilgange.

X

Simple Hit Counter