מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

סימון תאי גזע וצאצאיהם בשושלת עכברים מהונדסת בלתי ניתנת להשראה מאפשר ניתוח מרחבי וטמפורלי של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות של תאי גזע בוגרים במוח in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדשני על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-עוצמה. היתרונות של גישות מעקב אחר שושלת מהונדסת כוללים ספציפיות של התחקות אחר שושלת תאים מסוימת, ביטוי בל יימחה של החלבון הפלואורסצנטי ללא קשר לתחלופת תאים או התמיינות, רעילות נמוכה של דוקסיצילין, הפעלה מותנית וקלות שימוש עם בדיקות נפוצות במורד הזרם על רקמות עקבות של שושלת, כולל חיסון וחיסון.פלואורסצנציה.

בשל ההשלכה הרחבה של פלסטיות ותאים במוח הבוגר, אפיון וניתוח של תאי גזע בוגרים יסייעו ליידע את המחקר של מחלות נוירודגנרטיביות, השפעות מטבוליות על פלסטיות המוח, הזדקנות ומצבים קשורים אחרים. כדי להתחיל, שקופיות חמות לטמפרטורת החדר ולאחר תיקון עם אצטון קר כקרח במשך 15 דקות. יש לשטוף את השקופיות במשך חמש דקות במאגר שטיפה פי 1, תוך רעד של 60 סיבובים בדקה בטמפרטורת החדר בין כל שלב.

יש לחלחל לעמידה של אנטיגנים גרעיניים עם 0.3% טריטון X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize עבור עמידה של אנטיגנים ציטופלסמיים עם 0.3% Tween-20 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בצע שליפת אנטיגן על ידי שקופיות מיקרו-חיווט ב- 50 עד 100 מיליליטרים של 1x DAKO Antigen Retrieval Solution על נמוך למשך 10 דקות, פעמיים.

לאחר מכן, יש לשטוף עם חיץ במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. דגירה מחליקה ב 0.3% טיפוגן שחור ב 70% אתנול למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשטוף עם מאגר שטיפה. ציירו מחסום הידרופובי סביב הרקמה.

חסום למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם ריאגנט חוסם. ודגירה עם נוגדן ראשוני מדולל בדילול נוגדנים בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. יש לשטוף שקופיות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

למחרת, הדגירה של מקטעים בנוגדנים משניים של Alexa Fluor במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף שקופיות פעמיים במאגר שטיפה למשך 10 דקות. מכסים מקטעי מוח ב-100 מיקרוליטרים של נוגדן אחד עד 500 נגד GFP המצומדים ל-AlexaFluor 488, ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כדי להגביר את הפלואור4 האנדוגני, תוך סימון התאים העקבות.

למחרת, יש לשטוף עם מאגר שטיפה פעמיים. ואז לשטוף במי DI זורמים במשך חמש דקות. נגדי עם 100 ננוגרם למיליליטר 4’6-דיאמידינו-2-פנילינדול במשך חמש דקות.

לאחר מכן לשטוף במי DI זורמים במשך חמש דקות. הוסיפו טיפה של מדיום הרכבה פלואורסצנטית בטוחה על גבי כל מקטע רקמה ואטמו עם כיסוי של 22 מילימטר על 22 מילימטר. הדמיה מומלצת ביום ההרכבה כדי להבטיח אות אופטימלי.

כדי להתחיל קיבוע וחתך בעקבות פרפוזיה טרנסקרדיאלית לאחר תיקון מוחות ב 4%PFA לילה בארבע מעלות צלזיוס. ואז שוב לשעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את המוחות ב-1x PBS במשך שעה פעמיים בטמפרטורת החדר.

חותכים את המוח לחתיכות בעובי מילימטר אחד באמצעות גוש המוח הסגיטלי ומניחים לתוך חמישה צינורות מיקרו צנטריפוגה של מיליליטר המכילים 1x PBS. לפני הטיפול במתנול, התחילו בשטיפה עם 1x PBS למשך שעה אחת פעמיים בטמפרטורת החדר. יש לשטוף ב-50% מתנול למשך שעה בטמפרטורת החדר.

יש לשטוף ב-80% מתנול למשך שעה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף ב-100% מתנול למשך שעה, פעמיים, בטמפרטורת החדר. דגימות אקונומיקה עם 5% מי חמצן ב-20%דימתיל סולפוקסיד ומתנול בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה.

לאחר ההלבנה, שטפו דגימות במתנול במשך שעה אחת פעמיים בטמפרטורת החדר. יש לשטוף ב-20% דימתיל סולפוקסיד ומתנול במשך שעה אחת פעמיים בטמפרטורת החדר. יש לשטוף ב-80% מתנול למשך שעה בטמפרטורת החדר.

יש לשטוף ב-50% מתנול למשך שעה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף ב-PBS במשך שעה אחת פעמיים בטמפרטורת החדר. יש לשטוף ב-PBS 0.2%Triton X-100 למשך שעה אחת פעמיים בטמפרטורת החדר.

עבור אימונוסטין של מוחות מנקים, התחילו על ידי דגירה של דגימות ב-1x PBS, 0.2%Triton X-100, 20%DMSO, 0.3 גליצין טוחן, ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר מסלולי. יש לחסום ב-1x PBS, 0.2%Triton X-100, 10%DMSO, 6% סרום עיזים ב-37 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים על שייקר מסלולי. שטפו דגימות ב-1x PBS, 0.2%Tween-20, 10 מיקרוגרם למיליליטר מלח נתרן הפרין מרירית חזירית למשך שעה אחת פעמיים ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, דגירה ב 1x PBS, 0.2%Tween-20, 10 מיקרוגרם למיליליטרים הפרין, 5%DMSO, 3% סרום עיזים המכיל אחד עד 500 ריכוז של ארנב נגד GFP AlexaFluor 488 ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלול במשך יומיים. שטפו דגימות ב-1x PBS, 0.2%Tween-20 עם 10 מיקרוגרם למיליליטר הפרין במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי שלוש פעמים ואז פעם ביום במשך יומיים. דגימות דגירה למשך הלילה במיליליטר אחד של 50% טטרהידרופורן ומים.

דגימות הדגירה במשך שעה אחת במיליליטר אחד של 80% THF Tetrahydrofuran ומים. דגימות דגירה פעמיים במשך שעה אחת ב-100% טטרהידרופורן. יש לייבש דגימות עם מגבון סטרילי ולדגום בדיכלורומתאן עד שהן שוקעות לתחתית הבקבוקון.

אין לדגום במשך יותר מ -60 דקות. הדגירה של דגימות במיליליטר אחד של אתר דיבנזיל עד לבירור. אחסן דוגמאות באתר דיבנזיל בטמפרטורת החדר עד שיהיה מוכן לתמונה.

כדי לצלם מקטעי מוח מוכתמים במערכת החיסון, נתחו שקופיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, שבהן ניתן לאשר ביטוי משותף של נוגדנים מרובים. אנו משתמשים בחמישה מיקרוסקופים של לייקה סטלריס עם גלאי HyD S היברידיים. כדי לצלם מוחות מנוקים, השתמשו במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם שלב אוטומטי ופונקציית ריצוף אוטומטית.

התחילו בהנחת קטע מוח מנוקה שטוח על צלחת תחתית זכוכית בשקע באתר דיבנזיל. הבדל ניכר בעוצמת הפלואורסצנטים באזורי מוח שונים ובסוגי תאים שונים נצפה לאחר תקופת מרדף דופק במוחות שעקבו אחריהם. לתאי אפיתל כורואידים במקלעת הכורואידית היו קרום תאים עבה ואות פלואורסצנטי ירוק חזק המעידים על כך שהם נגזרו מתאים חיוביים של טרט שניתן היה להבחין ביניהם בקלות לבין התאים הסובבים אותם.

לסוגי התאים הקטנים האחרים בסטרומה של מקלעת הכורואידים היה אות GFP חלש יותר. במוח הקטן, תאי גליה של ברגמן ביטאו רמות גבוהות יותר של GFP מאשר תאי סל, ושונות בביטוי GFP הייתה קיימת גם בין תאי סל בודדים. עבור אקסונים של נוירונים חושיים במפעל בתוך השכבה הגלומרולרית של נורת חוש הריח ביטאו גם רמות גבוהות של אקסונים של נוירונים חושיים בחוש הריח GFP הממלאים את השכבה הגלומרולרית של נורת חוש הריח ביטאו רמות גבוהות של עגבניות ממברנה, או פלואורסצנציה אדומה בהשוואה לרוב אזורי המוח האחרים גם כאשר אותם נוירונים חיוביים ל-GFP, מה שמעיד על כך שנראה כי תאים מסוימים איבדו את האות mTomato לאט יותר במהלך מעקב אחר שושלת.

לעומת זאת, במקלעת הכורואידית GFP תאים חיוביים ביטאו mTomato נמוך. ברוב האזורים האחרים במוח, אותות עגבניות התבטאו ברמה נמוכה ברוב סוגי התאים, כאשר תאי האנדותל היו חלק מהתאים היחידים שהאות הפלואורסצנטי שלהם היה בהיר מספיק כדי להתבלט באופן מובהק מהרקע הפלואורסצנטי האדום של רקמת המוח. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא שהאות הפלואורסצנטי במוחות מנוקים נמוג מהר יותר מרוב מבחני החיסון האחרים.

זכור לצלם את הדוגמאות שלך בהקדם האפשרי ותוך שבעה ימים. לאחר מכן, הדמיה של פרוסות המוח או מוחות צלולים, צביעה של סמנים עם אותות GFP וכימות הפלואורנציה שלנו יכולים להתבצע באמצעות תוכנות.