Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Het markeren van stamcellen en hun nakomelingen met een induceerbare transgene afstammingslijn maakt ruimtelijke en temporele analyse mogelijk van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie van volwassen stamcellen in de hersenen in vivo. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, respons op interventies en multi-potentie. Voordelen van transgene lineage tracing-benaderingen zijn onder meer specificiteit van het traceren van een bepaalde cellijn, onuitwisbare expressie van het fluorescerende eiwit ongeacht celvernieuwing of -differentiatie, lage toxiciteit van doxycyline, voorwaardelijke activering en gebruiksgemak met gemeenschappelijke downstream-testen op afstammingsspoorweefsels, waaronder immunostaining en immunofluorescentie.

Vanwege de brede implicatie van plasticiteit en cel in de volwassen hersenen, zal de karakterisering en analyse van volwassen stamcellen helpen informeren over de studie van neurodegeneratieve ziekten, metabole effecten op hersenplasticiteit, veroudering en andere gerelateerde aandoeningen. Om te beginnen, warm glijdt naar kamertemperatuur en post-fix met ijskoude aceton gedurende 15 minuten. Wasglaasjes gedurende vijf minuten in 1X spoelbuffer, schudden met 60 rotaties per minuut bij kamertemperatuur tussen elke stap.

Permeabiliseren voor het staan van nucleaire antigenen met 0,3% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Permeabiliseren voor het staan van cytoplasmatische antigenen met 0,3% Tween-20 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voer antigeen ophalen uit door dia’s in de magnetron te doen in 50 tot 100 milliliter 1x DAKO Antigen Retrieval Solution op laag gedurende 10 minuten, tweemaal.

Spoel vervolgens met buffer gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. incubeer dia’s in 0,3% Typogen Black in 70% ethanol gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en was vervolgens met spoelbuffer. Teken hydrofobe barrière rond weefsel.

Blok gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius met blokkerend reagens. En incubeer met primair antilichaam verdund in antilichaam verdund in antilichaam verdunningsmiddel ‘s nachts bij vier graden Celsius. Was dia’s gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.

De volgende dag incubeer secties in Alexa Fluor secundaire antilichamen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens glaasjes twee keer in spoelbuffer gedurende 10 minuten. Bedek hersensecties in 100 microliter van één tot 500 anti-GFP-antilichamen geconjugeerd aan AlexaFluor 488 en incubeer ‘s nachts bij vier graden Celsius om de endogene Fluor4 te stimuleren, waardoor de getraceerde cellen worden gemarkeerd.

Was de volgende dag twee keer met spoelbuffer. En was vervolgens vijf minuten in stromend DI-water. Counterstain met 100 nanogram per milliliter 4’6-diamidino-2-fenylindool gedurende vijf minuten.

Was vervolgens vijf minuten in stromend DI-water. Voeg een druppel fluorescerend veilig montagemedium toe aan elke weefselsectie en sluit af met een afdekplaat van 22 millimeter bij 22 millimeter. Beeldvorming wordt aanbevolen op de dag van montage om een optimaal signaal te garanderen.

Om te beginnen met fixatie en sectie na transcardiale perfusie post-fix hersenen in 4% PFA ‘s nachts bij vier graden Celsius. En dan weer een uur op kamertemperatuur. Was de hersenen in 1x PBS gedurende een uur tweemaal op kamertemperatuur.

Snijd de hersenen in een millimeter dikke secties met behulp van het sagittale hersenblok en plaats in vijf milliliter microcentrifugebuizen met 1x PBS. Voor methanol voorbehandeling, begin met wassen met 1x PBS gedurende een uur tweemaal op kamertemperatuur. Was in 50% methanol gedurende een uur op kamertemperatuur.

Was in 80% methanol gedurende een uur op kamertemperatuur. Was in 100% methanol gedurende een uur, twee keer, op kamertemperatuur. Bleekmonsters met 5% waterstofperoxide in 20% dimethylsulfoxide en methanol bij vier graden Celsius ‘s nachts.

Was na het bleken monsters gedurende een uur tweemaal op kamertemperatuur in methanol. Was in 20% dimethylsulfoxide en methanol gedurende een uur tweemaal op kamertemperatuur. Was in 80% methanol gedurende een uur op kamertemperatuur.

Was in 50% methanol gedurende een uur op kamertemperatuur. Was tweemaal een uur in PBS op kamertemperatuur. Was tweemaal één uur in PBS 0,2% Triton X-100 bij kamertemperatuur.

Voor immunostain van het opruimen van hersenen, begin met het incuberen van monsters in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 molaire glycine, bij 37 graden Celsius ‘s nachts op een orbitale shaker. Blok in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% geitenserum bij 37 graden Celsius gedurende drie dagen op een orbitale shaker. Was monsters in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgram per milliliter heparine natriumzout uit varkensslijmvlies gedurende tweemaal één uur bij 37 graden Celsius.

Incubeer vervolgens in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 microgram per milliliter heparine, 5% DMSO, 3% geitenserum met één tot 500 concentratie konijn anti GFP AlexaFluor 488 bij 37 graden Celsius op een orbitale shaker gedurende twee dagen. Was monsters in 1x PBS, 0,2% Tween-20 met 10 microgram per milliliter heparine gedurende één uur bij 37 graden Celsius op een orbitale shaker drie keer en vervolgens eenmaal per dag gedurende twee dagen. Incubeer monsters ‘s nachts in één milliliter van 50% Tetrahydrofuran en water.

Incubeer monsters gedurende een uur in één milliliter van 80% THF Tetrahydrofuran en water. Incubeer monsters twee keer gedurende een uur in 100% Tetrahydrofuran. Droog monsters met een steriel doekje en incubeer in dichloormethaan totdat ze naar de bodem van de injectieflacon zinken.

Niet langer dan 60 minuten incuberen. Incubeer monsters in één milliliter dibenzylether tot ze helder zijn. Bewaar monsters in dibenzyllether bij kamertemperatuur totdat ze klaar zijn om te worden afgebeeld.

Om immunostained hersensecties in beeld te brengen, analyseert u dia’s via confocale microscopie, waar co-expressie van meerdere antilichamen kan worden bevestigd. We gebruiken een Leica Stellaris vijf microscoop met HyD S hybride detectoren. Om gewiste hersenen in beeld te brengen, gebruikt u een omgekeerde confocale microscoop met een geautomatiseerd stadium en een geautomatiseerde tegelfunctie.

Begin met het plat leggen van een opgeruimd hersengedeelte tegen een glazen bodemschaal in onderdompeling in dibenzylether. Een merkbaar verschil in fluorescerende intensiteit tussen verschillende hersengebieden en verschillende celtypen werd waargenomen na een pulsachtervolgingsperiode in de afstammingsgetraceerde hersenen. Choroïde epitheelcellen in de plexus choroïde hadden een dik celmembraan en een sterk groen fluorescerend signaal dat aangeeft dat ze afkomstig waren van Tert-positieve cellen die gemakkelijk te onderscheiden waren van de omliggende cellen.

De andere kleinere celtypen in het choroïde plexus stroma hadden een zwakker GFP-signaal. In het cerebellum brachten Bergmann-gliacellen hogere niveaus van GFP tot expressie dan mandcellen, en variatie in GFP-expressie bestond ook tussen individuele mandcellen. Voor fabriekssensorische neuron-axonen binnen de glomerulaire laag van de olfactorische bol werden ook hoge niveaus van GFP Olfactorische sensorische neuron-axonen tot expressie gebracht die de glomerulaire laag van de olfactorische bol vullen, hoge niveaus van membraantomaat, of rode fluorescentie in vergelijking met de meeste andere hersengebieden, zelfs wanneer dezelfde neuronen GFP-positief zijn, wat aangeeft dat sommige cellen het mTomato-signaal langzamer leken te verliezen tijdens het traceren van afstamming.

In de plexus choroid plexus daarentegen brachten positieve cellen een lage mTomato tot expressie. In de meeste andere hersengebieden kwamen tomatensignalen op laag niveau tot expressie in de meeste celtypen, waarbij endotheelcellen enkele van de enige cellen waren waarvan het fluorescerende signaal helder genoeg was om duidelijk te onderscheiden van de rode fluorescerende achtergrond van het hersenweefsel. Het belangrijkste om te onthouden is dat het fluorescerende signaal in gewiste hersenen sneller vervaagt dan de meeste andere immunotests.

Vergeet niet om uw monsters zo snel mogelijk en binnen zeven dagen in beeld te brengen. Vervolgens kunnen beeldvorming van de hersensegmenten of heldere hersenen, inkleuring van markers met de GFP-signalen en onze kwantificering van fluorence worden uitgevoerd met behulp van softwareprogramma’s.