Identifiera kaspaser och deras motiv som klyver proteiner under influensa A-virusinfektion

Denna metod hjälper till att bestämma och bekräfta om ett protein i influensavirusinfekterade celler genomgår nedbrytning eller klyvning av caspaser och identifiera kaspasklyvningsställena. Denna metod kräver endast grundläggande molekylär- och cellbiologiska laboratorieinställningar och forskningsfärdigheter och kräver ingen specialutrustning eller mjukvaruutbildning. Denna metod kan anpassas för att uppnå liknande mål som involverar infektion med andra djurvirus eller mikrober och exponering för yttre stimuli, som toxiner och kemikalier.

Till att börja med, frö MDCK- eller A549-celler i en 12-brunns cellodlingsplatta. Inkubera cellerna över natten vid 37 grader Celsius under en 5% koldioxidatmosfär. Nästa dag, ta bort det gamla odlingsmediet från cellerna och tvätta cellerna i varje brunn två gånger med en milliliter serumfri MEM.

Infektera sedan cellerna genom att tillsätta 400 mikroliter influensa A-virusinokulum och placera plattan för inkubation i en timme. Efter inkubation, ta bort virusinokulum och tvätta cellerna med MEM. Tillsätt en milliliter serumfri MEM till varje brunn och inkubera cellerna som visas i föregående steg.

Efter 24 timmar, skörda cellerna genom att skrapa dem med en en-milliliter sprutkolv och överför dem till ett 1,5 ml rör. Centrifugera röret vid 12 000 G i två minuter vid rumstemperatur och samla supernatanten. Tvätta cellpelleten med 250 mikroliter fosfatbuffrad saltlösning och centrifug.

Ta bort supernatanten och tillsätt 100 mikroliter celllysbuffert. Blanda med virvel. Värm röret vid 98 grader Celsius i 10 minuter för att helt lysera cellerna.

Lös sedan lika stora mängder protein från oinfekterade och infekterade prover med standard SDS-polyakrylamidgelelektrofores. Efter elektrofores, överför proteingelén till ett nitrocellulosa- eller PVDF-membran och utför Western blotting. Jämför proteinnivåerna i de mock-behandlade och inhibitorbehandlade infekterade provbanorna.

I 100 mikroliter lämpligt medium, som Opti-MEM, späd 100 nanomolarer kontroll- eller kaspas-siRNA, eller lämplig volym transfektionsreagens. Inkubera i fem minuter vid rumstemperatur. Blanda 100 mikroliter av varje siRNA-lösning med 100 mikroliter transfektionsreagenslösning och inkubera i 20 till 45 minuter vid rumstemperatur.

Dela och tillsätt 100 000 MDCK- eller A549-celler i 800 mikroliter av det fullständiga tillväxtmediet. Tillsätt 200 mikroliter siRNA-transfektionsreagenskomplex och tillsätt denna suspension till en odlingsplatta med 12 brunnar. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius under en 5% koldioxidatmosfär i 72 timmar.

Infektera cellerna med influensa A-virus, men utan hämmare. Utför Western blotting och jämför proteinnivåerna som visats tidigare. Leta reda på caspas-klyvningsmotiven XXXD och DXXD på polypeptid.

Mutera P1-asparaginsyran, två glutaminsyra eller alanin genom platsstyrd mutagenes och bekräfta genom DNA-sekvensering. Späd i 100 mikroliter av ett lämpligt medium två mikrogram vildtyps- eller mutantplasma-DNA eller rekommenderad volym av transfektionsreagens och inkubera rören i fem minuter vid rumstemperatur. Blanda 100 mikroliter plasma-DNA-lösning med 100 mikroliter transfektionsreagenslösning och inkubera i 20 till 45 minuter vid rumstemperatur.

Under tiden delar du upp och lägger till 300 000 MDCK- eller A549-celler till 800 mikroliter komplett tillväxtmedium. Tillsätt 200 mikroliter DNA-transfektionsreagenskomplex och tillsätt denna suspension till en odlingsplatta med 12 brunnar. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius under en 5% koldioxidatmosfär.

Efter 48 timmar, infektera cellerna med influensa A-virus utan hämmare. Utför Western blotting och jämför proteinnivåerna som visats tidigare. Med hjälp av Western blotting utvärderades nedbrytningen av värdkortaktin av influensainducerade värdkaspaser.

Behandling av influensavirusinfekterade celler med en caspase-3-hämmare resulterade i räddning av kortaktin och viral NP-nedbrytning. Kvantifiering av intensiteten hos kortaktinband och dess normalisering med motsvarande aktinband visade att nivån av kortaktin i caspase-3-hämmare behandlade infekterade celler var högre jämfört med obehandlade infekterade celler. I caspase-6 eller caspase-7 utarmade celler.

Ingen signifikant återhämtning i kortaktinpolypeptidnivåer observerades, medan i kaspas-3-utarmade celler återhämtade sig kortaktin från influensavirusinducerad nedbrytning. Kvantifiering och jämförelse av polypeptidnivåer visade att kortaktinpolypeptidnivån i infekterade celler med utarmat caspase-3-uttryck var högre än celler med normalt caspase-3-uttryck. Mutationen av asparaginsyra vid position 116 till glutaminsyra gjorde kortaktinpolypeptid resistent mot nedbrytning av influensavirusinducerad.

Kvantifiering och jämförelse av polypeptidnivåer visade att nivån av mutant kortaktinpolypeptid i infekterade celler var högre än för kortaktinpolypeptid av vild typ. Det är nödvändigt att generera tiotals mutanter och utföra upprepad Western blotting för att identifiera caspas-klyvningsstället i polypeptid. En biokemisk analys in vitro innehållande renat kaspas och målpolypeptid kan utvecklas för att bekräfta att proteinet av intresse är ett direkt gasbaserat substrat.

Detta protokoll hjälper till att förstå betydelsen, nedbrytningen eller klyvningen av målprotein i systemet som studeras, såsom virusinfektion eller en sjukdom.