Isolatie van kleine preantrale follikels uit de runder eierstok met behulp van een combinatie van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie

Dit protocol maakt de efficiënte en herhaalbare isolatie mogelijk van pre-antrale follikels in een vroeg stadium van een enkele runder eierstok en het creëert nieuwe mogelijkheden voor de studie van ovariële folliculogenese bij een niet-rundersoort. Door een groter aantal follikels uit een enkele eierstok te gebruiken, maakt deze techniek in vivo behandelingen mogelijk vóór de eierstokoogst, of obtentie van meerdere monsters in de loop van de tijd van hetzelfde dier via ovariumbiopsie. Isolatie en cryo-conservering van pre-antrale follikels in een vroeg stadium kan een waardevolle optie zijn voor vruchtbaarheidsbehoud bij jonge vrouwen die een gonadotoxische behandeling ondergaan, zoals chemotherapie, evenals kiemplasmabehoud van bedreigde soorten.

De procedure wordt gedemonstreerd door Stephanie McDonnell, Amanda Morton en Juliana Candelaria, promovendi uit mijn laboratorium. Breng om te beginnen eierstokken over in het laboratorium naar warme, steriele PBS met Pen-Strep en selecteer eierstokken met veel kleine antrale follikels en geen prominent corpus lutetium. Verwijder overtollig bindweefsel en vet uit de eierstokken met een schaar.

Breng een eierstok over op de snijplank op het bankpapier. Snijd met behulp van een scalpel de eierstok in de lengterichting doormidden van de ene ligamentaanhechtingsplaats naar de tegenovergestelde aanhechtingsplaats. Bewaar de ene helft van de eierstok op de te verwerken snijplank en plaats de andere helft van de eierstok terug in warme PBS met Pen-Strep.

Om het medulla te verwijderen, snijdt u langs de kromming van de eierstok op ongeveer 2 millimeter afstand van het oppervlak zonder door de cortex te snijden met het blootgestelde medulla naar boven gericht. Snijd door de snede naar beneden om het grootste deel van de medulla te verwijderen. Draai de eierstok half om zodat het epitheel naar boven is gericht en gebruik het scalpel om het medulla weg te snijden van de cortex en snijd het resterende witte bindweefsel rond de rand van het eierstokstuk weg dat verbonden was met de ligamenten.

Zodra het grootste deel van het medulla is verwijderd, gebruikt u het scalpel om de cortex tot ongeveer 1 millimeter dikte te snijden terwijl u het scalpel manipuleert met kleine heen-en-weer bewegingen om de rest van het medulla weg te scheren en snijdt u vervolgens elke eierstokschors in twee stukken. Houd de cortexstukken in warme PBS met Pen-Strep totdat ze klaar zijn om te hakken. Breng een enkel stuk van de cortex over naar de petrischaal op de weefselhakselaar en maak het weefsel nat met drie of vier druppels warme PBS met Pen-Strep.

Terwijl u het stuk weefsel stabiel houdt met een tang, drukt u eenmaal op de Reset-knop om de weefselhakselaar te starten. Nadat het hele stuk van de cortex in stroken is gesneden, gebruikt u de knop van de meshouder om het mes van de petrischaal te tillen en de tang om weefsel van het mes te verwijderen. Nadat u de plaathouder 90 graden hebt gedraaid, drukt u nogmaals op de Reset-knop en passeert u het mes volledig door de weefselstrips.

Gebruik de knop van de meshouder om het mes van de petrischaal en de tang te tillen om weefsel van het mes te verwijderen, zoals eerder is aangetoond. Was met behulp van een transferpipet en warme PBS met Pen-Strep het gehakte weefsel in een voorverwarmde conische buis van 50 milliliter. Breng de conische buis terug naar het water of kraalbad om het gehakte weefsel warm te houden terwijl u de hakprocedure herhaalt met de andere drie helften van de eierstok.

Voor het beste snijresultaat gebruikt u de moerdriver om de moer van de hakarm te verwijderen en de ring en messluiting te verwijderen. Verwijder met een tang het mes van de hakarm. Draai het om zodat de ongebruikte rand naar de petrischaal is gericht en plaats deze terug op de hakarm.

Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de homogenisatoreenheid is aangesloten en de snelheid is ingesteld op de tweede balk, plaatst u de generatorsonde van 10 millimeter in de eenheid volgens de specificaties van de fabrikant. Stel vervolgens een timer in voor 1 minuut en plaats de sonde in de conische buis van 50 milliliter met het gehakte cortexweefsel van één eierstok en voldoende PBS met Pen-Strep om de buis te vullen tot de 25 milliliterlijn. De diepte waarop de sonde wordt ingebracht, moet 1/3 van de hoogte van de vloeistof zijn, gemeten vanaf de bodem van de kamer.

Zodra de timer start, schakelt u de homogenisator in, zorgt u ervoor dat de onderkant van de sonde de buis niet raakt en houdt u de buis stil terwijl de homogenisator is ingeschakeld. Verwijder na 1 minuut homogenisatie de sonde uit de buis en verwijder vervolgens het bindweefsel dat de ontluchtingsgaten verstopt in de ruimte tussen het rotormes en de rotorbuis of cortexstukken die met een tang in de sonde zijn geplakt en plaats ze terug in de buis. Giet het gedispergeerde weefsel in de met kaasdoek bedekte trechter, ingebracht in de Erlenmeyer en spoel de inhoud van de buis in de trechter met behulp van warme PBS.

Spoel tot slot het kaasdoek af met warme PBS. Forceer de vloeistof in kleine fragmenten om door de gaten van de doek te gaan door de kaasdoek rond de weefselfragmenten naar beneden te draaien en te knijpen totdat alle overtollige vloeistof en weefsel uit de kaasdoek zijn verwijderd. Nadat u het kaasdoek over de trechter hebt geopend, spoelt u het kaasdoek met PBS met Pen-Strep met behulp van een transferpipet en knijpt u opnieuw eventuele resterende weefselfragmenten door de doek.

Houd met behulp van een hemostat de celzeef van 300 micrometer boven een bekerglas van 200 milliliter en giet het filtraat in de Erlenmeyer door de celzeef. Als de celzeef verstopt raakt met weefsel, tikt u deze voorzichtig tegen het bekerglas, draait u de zeef ondersteboven en tikt u het grote weefselafval op het bankpapier. Spoel de inhoud van de kolf af met behulp van warme PBS met Pen-Strep totdat er geen weefselfragmenten achterblijven en giet deze in de celzeef.

Vervolgens, terwijl u de 40-micrometer celzeef met een hemostaat over een tweede bekerglas van 200 milliliter houdt, giet u al het initiële filtraat dat aanwezig is in het eerste bekerglas van 200 milliliter door de zeef en spoelt u vervolgens de inhoud van het bekerglas met behulp van warme PBS met Pen-Strep totdat er geen weefselfragmenten achterblijven en giet het in de celzeef. Nadat u de naald van 18 gauge op de spuit van 20 milliliter hebt gemonteerd, vult u de spuit met een follikelwasmedium. Houd met een hemostat de celzeef van 40 micrometer ondersteboven boven een vierkante petrischaal en gebruik de spuit om de inhoud van de celzeef in de schaal uit te spoelen.

Breng de vierkante petrischaal over op een stereoscoop met een warm podium ingesteld op 38,5 graden Celsius met een vergrotingsset tussen 1,25 en 3,2x. Nadat u de follikels uit de vierkante petrischaal hebt geïdentificeerd, brengt u de follikel over om middelgrote druppels te wassen met behulp van de micropipette. Het totale aantal geïsoleerde pre-antrale follikels per replicatie met behulp van weefselhomogenisatie van 6 minuten toont een gemiddelde van 41 follikels per replicaat, variërend van 11 tot 135 follikels.

Beoordeling van het ontwikkelingsstadium van 476 geïsoleerde follikels toonde aan dat de meerderheid zich in het primaire stadium van ontwikkeling bevond, met een afmeting van 40 tot 79 micrometer in het bevatten van één laag kuboïdale granulosacellen. Homogenisatie van de ovariële cortex gedurende 6 minuten leverde een groter aantal pre-antrale follikels op in vergelijking met 5 minuten homogenisatie met dezelfde snelheid. Transcriptexpressie van de granulosacelmarker FSH-receptor en kiemcelmarker DAZL in de follikels werd geëvalueerd met behulp van reverse transcriptie kwantitatieve PCR die aantoonde dat zowel primaire als vroege secundaire follikels FSH-receptor en DAZL-transcripten tot expressie brachten.

Immunofluorescente lokalisatie van CX37 in geïsoleerde pre-antrale follikels in zowel de primaire als de vroege secundaire stadia toont aan dat CX37 gelokaliseerd was in de O-plasm, afwezig in de kern van de O-site en in het membraan van de granulosacellen. In onze ervaring zijn een goede dissectie van een dunne laag corticale weefsel, het hakken van het weefsel tot de juiste grootte en een goede homogenisatie kritieke stappen om ervoor te zorgen dat levensvatbare follikels uit het weefsel vrijkomen. Geïsoleerde pre-antrale follikels kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden zoals regulatie van pre-antrale follikelgroei en de aard van interacties tussen granulosacellen en de eicel, waardoor de ontwikkeling van efficiëntere kweekomstandigheden wordt vergemakkelijkt.