Het bevorderen van de studie van preantrale folliculogenese vereist efficiënte methoden voor follikelisolatie van enkele eierstokken. Hier wordt een gestroomlijnd, mechanisch protocol gepresenteerd voor follikelisolatie van runderbitussen met behulp van een weefselhakselaar en homogenisator. Deze methode maakt het mogelijk om een groot aantal levensvatbare preantrale follikels uit een enkele eierstok te verzamelen.
Het begrijpen van het volledige proces van folliculogenese van zoogdieren is cruciaal voor het verbeteren van geassisteerde voortplantingstechnologieën bij vee, mensen en bedreigde soorten. Onderzoek is meestal beperkt gebleven tot antrale en grote preantrale follikels vanwege moeilijkheden bij de isolatie van kleinere preantrale follikels, vooral bij grote zoogdieren zoals runderen. Dit werk presenteert een efficiënte aanpak om grote aantallen kleine preantrale follikels uit een enkele runder eierstok op te halen. De cortex van individuele runderbitussen werd gesneden in kubussen van 500 μm met behulp van een weefselhakselaar en gedurende 6 minuten gehomogeniseerd bij 9.000-11.000 tpm met behulp van een 10 mm-sonde. Groot puin werd van het homogenaat gescheiden met behulp van een kaasdoek, gevolgd door seriële filtratie door celzeefmachines van 300 μm en 40 μm. De inhoud die in de zeef van 40 μm werd achtergebleven, werd gespoeld in een zoekschaal, waar follikels werden geïdentificeerd en verzameld in een druppel medium. De levensvatbaarheid van de verzamelde follikels werd getest via trypan blue-kleuring. Deze methode maakt de isolatie van een groot aantal levensvatbare kleine preantrale follikels uit een enkele runder eierstok in ongeveer 90 minuten mogelijk. Belangrijk is dat deze methode volledig mechanisch is en het gebruik van enzymen vermijdt om het weefsel te dissociëren, wat de follikels kan beschadigen. De follikels verkregen met behulp van dit protocol kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals isolatie van RNA voor RT-qPCR, immunolokalisatie van specifieke eiwitten en in vitro cultuur.
Ovariële follikels zijn de functionele eenheden van de eierstok, verantwoordelijk voor de productie van het gameat (eicel) en hormonen die cruciaal zijn voor de voortplantingsfunctie en de algehele gezondheid. Primordiale follikels vormen zich in de eierstok tijdens de foetale ontwikkeling of in de neonatale periode, afhankelijk van de soort1, en ze vormen het ovariële reservaat van een vrouw. Folliculaire groei begint met de activering van primordiale follikels die de rustpool verlaten en de groeifase ingaan. Preantrale folliculogenese, die alle follikelstadia vóór de ontwikkeling van het antrum omvat, is een zeer dynamisch proces dat synchrone morfologische en metabole veranderingen in de eicel en de omliggende granulosacellen vereist, aangedreven door nauwe communicatie tussen deze twee celtypen 2,3. Preantrale follikels vormen de meerderheid van de folliculaire eenheden die op een bepaald moment in de eierstok worden aangetroffen4. De ontwikkeling door de preantrale stadia van folliculogenese wordt geschat op enkele weken langer dan antrale ontwikkeling 5,6, en deze tijd is nodig voor de eicel en somatische cellen om voldoende volwassenheid te verwerven om de laatste fase van ontwikkeling (d.w.z. het antrale stadium) in te gaan en zich voor te bereiden op ovulatie, bevruchting en embryonale ontwikkeling 7,8,9.
Veel van de huidige kennis over ovariële preantrale folliculogenese komt van muismodellen 10,11,12,13, deels vanwege het gemak bij het herstellen van een groot aantal van deze follikels uit een kleinere en minder vezelige eierstok. Hoewel meldingen van isolatie van grote aantallen preantrale follikels uit runderbieuze eierstokken ongeveer 30 jaar oud zijn14, is een vollediger begrip van de processen die de ontwikkeling van deze follikels in een vroeg stadium reguleren, niet gerealiseerd, grotendeels vanwege het gebrek aan geoptimaliseerde, efficiënte en herhaalbare methoden om voldoende aantallen levensvatbare preantrale follikels op te halen, vooral in vroege stadia van ontwikkeling. Met de toenemende belangstelling voor het behoud van de ovariële reserve voor toekomstig gebruik bij geassisteerde voortplanting bij mensen, worden koeien een aantrekkelijk model vanwege hun meer vergelijkbare ovariële structuur15. De runderkolvis is echter aanzienlijk rijker aan collageen in vergelijking met de eierstok van de muis16, waardoor mechanische isolatie met behulp van methoden die voor de muis zijn beschreven, zeer inefficiënt is. Inspanningen om vruchtbaarheidsbehoudstechnieken uit te breiden omvatten volledige in vitro groei van preantrale follikels tot het antrale stadium, gevolgd door in vitro rijping (IVM) van de ingesloten eicellen, in vitro fertilisatie (IVF) en embryoproductie en -overdracht17. Tot nu toe is dit hele proces alleen bereikt bij muizen18. Bij runderen is de vooruitgang in de richting van follikelgroei in vitro beperkt tot enkele rapporten met variabele follikelstadia aan het begin van de kweek, evenals variabele lengte van de cultuur tussen protocollen17,19.
De in de literatuur beschreven methoden voor de oogst van preantrale follikels uit de runderkolvis hebben meestal mechanische en enzymatische technieken gebruikt, geïsoleerd of in combinatie 2,14,17,20. Het eerste rapport van een protocol voor runderpreantrale follikelisolatie gebruikte een weefselhomogenisator en seriële filtratie om hele eierstokken te verwerken20. Deze studie werd gevolgd door rapporten die mechanische en enzymatische procedures combineerden die collagenase14 gebruikten. Een terugkerend thema bij het gebruik van collagenase om het eierstokweefsel te verteren, is het potentiële risico op schade aan het folliculaire keldermembraan, wat de levensvatbaarheid van de follikel in gevaar kan brengen 14,21,22,23. Daarom zijn verschillende combinaties van mechanische methoden gebruikt, zoals het gebruik van een weefselhakselaar en herhaald pipetteren of een weefselhakselaar gecombineerd met homogenisatie 20,24,25,26. Een andere mechanische techniek die is beschreven, maakt gebruik van naalden om preantrale follikels rechtstreeks uit het eierstokweefsel te ontleden, wat vooral handig is voor het isoleren van grotere (> 200 μm) secundaire follikels. Dit proces is echter tijdrovend, inefficiënt voor het isoleren van kleinere preantrale follikels en is afhankelijk van vaardigheden wanneer het wordt geprobeerd in runderbieuze eierstokken 19,27,28.
Gebruikmakend van de verschillende technieken die in de literatuur worden beschreven, was dit protocol gericht op het optimaliseren van de isolatie van preantrale follikels uit enkele rundervliegen op een eenvoudige, consistente en efficiënte manier die incubatie in enzymatische oplossingen vermijdt. Het verbeteren van de methoden om preantrale follikels te isoleren zal een kans bieden om het begrip van dit stadium van folliculogenese te vergroten en de ontwikkeling van effectieve kweeksystemen mogelijk te maken om preantrale follikels tot het antrale stadium te ontwikkelen. De gedetailleerde procedures die hierin worden beschreven voor de isolatie van preantrale follikels van een groot zoogdier zoals de rundersoort zullen van vitaal belang zijn voor onderzoekers die vroege folliculogenese willen bestuderen in een niet-muizensoort die vertaalbaar is naar mensen.
Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare methode om preantrale follikels in een vroeg stadium, met name in primaire en vroege secundaire stadia, uit de runderkolvisus te halen. Dit protocol bouwt voort op eerdere rapporten 20,25,30,34,35,36 en biedt optimalisaties die resulteren in de isolatie van een betekenisvol aantal follikels uit een individuele eierstok.<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door USDA Multi-state project W4112 en UC Davis Jastro Shields award aan SM.
De auteurs willen hun waardering uitspreken voor Central Valley Meat, Inc. voor het leveren van de rundervliegen die in alle experimenten worden gebruikt. De auteurs bedanken ook Olivia Silvera voor hulp bij eierstokverwerking en follikelisolatie.
5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
#21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |