تحديد موحد للبنية المركبة في الطب التبتي باستخدام مطياف كتلة مصيدة الأيونات وتحليل التجزئة متعدد المراحل

يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين في تحليل هياكل مركبات الطب التبتي ، وخاصة مكونات الشجرة. يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة للدراسة النوعية لمحتوى المركب في الطب الطبيعي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن دقة الهيكل المركب الذي تم الحصول عليه في هذه الحالة أعلى من دقة قاعدة البيانات.

يمكن استخدام هذه التقنية في تحليل بنية المواد الوسيطة الأيضية في المثانة أو البول. للبدء ، إعداد عينة بذور الطب التبتي Abelmoschus manihot. قم بوزن جرام واحد من AMS بدقة وضعه في دورق مخروطي يحتوي على 30 ملليلتر من 80٪ ميثانول.

باستخدام سونيكاتور حمام الموجات فوق الصوتية في 40 كيلو هرتز ، قم بإجراء الاستخراج على الخليط لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية. ثم ، الطرد المركزي العينة في 14،000g لمدة خمس دقائق. قم بإعداد حقنة حقن ومرشح غشاء عضوي صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرون ، وقم بتصفية المادة الطافية في زجاجة عينة سعة 2 ملليلتر.

بعد تشغيل مفتاح مضخة التفريغ ، افتح الصمام الرئيسي لأسطوانة الأرجون مع صمام الضغط الجزئي واضبط الضغط على حوالي 0.3 ميجاباسكال. ثم افتح صمام النيتروجين. قم بتشغيل برنامج التحكم في قياس الطيف الكتلي ، أو MS.

انقر فوق مصدر ESI المسخن في لوحة البرنامج واضبط معلمات MS ، بما في ذلك درجة حرارة السخان ومعدلات تدفق الغاز وجهد الرش للأوضاع الإيجابية والسلبية ودرجة حرارة الشعيرات الدموية. انقر فوق الزر “تطبيق” لتنشيط مصدر الأيونات للكروماتوغرافيا السائلة أو LC.قم بإعداد المرحلتين المتحركتين A و B باستخدام 0.1٪ حمض الفورميك في محلول مائي في الأسيتونيتريل النقي على التوالي. قم بتفريغها في جهاز صوتي حمام الموجات فوق الصوتية عند 40 كيلو هرتز لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل توصيل المحاليل بممرات السوائل A و B على التوالي.

قم بإعداد محلول ماء ميثانول بحجم 1: 9 ، ثم املأه يدويا في زجاجات السوائل النظيفة للمضخة والحاقن. بعد تشغيل برنامج التحكم LC-MS ، انقر فوق التحكم المباشر لفتح لوحة تحكم LC. افتح صمام التطهير في اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة على وحدة المضخة.

انقر فوق المزيد من الخيارات لفتح إعداد المضخة وتعيين معلمات التطهير عند خمسة ملليلتر في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. انقر فوق تطهير لبدء إزالة الفقاعة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، أغلق صمام التطهير.

ثم ، انقر فوق Prime Syringe لشطف المحقنة لمدة ثلاث دورات ، و Wash Buffer Loop لشطف الحلقة لدورة واحدة ، و Wash Needle خارجيا لغسل الإبرة لدورة واحدة. ضع زجاجة العينة في جهاز أخذ العينات. انقر فوق إعداد الأداة لفتح نافذة تحرير الطريقة وانقر فوق جديد لإنشاء طريقة أداة LC-MS جديدة.

قم بإنشاء وقت تشغيل إجمالي للطريقة وقم بتعيين حد الضغط. معدل التدفق الإجمالي وتدرج التدفق ودرجة حرارة العينة ودرجة حرارة العمود ودلتا درجة الحرارة الجاهزة في نافذة تحرير الطريقة. بالنسبة لأسلوب MS، حدد نوع تجربة MS أو MSn عام.

أدخل قيم وقت الاستحواذ والقطبية ونطاق الكتلة ورقم قيمة التحويل والمدة. انقر فوق حفظ لتكوين الإعدادات كطريقة أداة. انقر فوق إعداد التسلسل لفتح جدول التسلسل ، حيث أدخل معلومات حول نوع العينة والملف والاسم والمسار ومعرف العينة وطريقة الأداة والموضع وحجم الحقن.

سجل جدول التسلسل بالنقر فوق حفظ ، ثم قم بتنفيذ الإعدادات وابدأ اكتساب MS. لتحميل بيانات MS في برنامج معالجة البيانات ، انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الخام في Explorer. في مخطط كروماتوجرام الذروة الأساسي BPI ، حدد الحد الأقصى للمساحة أسفل المنحنى أو AUC بالنقر فوق الماوس وسحبه.

سيتم عرض طيف MS المقابل في نفس النافذة. حدد أيون مستهدف لتحليل MS/MS التالي. أعد فتح نافذة تحرير الطريقة ، وفي جدول إعداد MSn ، قم بتعيين m / z للأيون المستهدف إلى منزلة عشرية واحدة في عمود الكتلة الأصلية.

بعد ذلك ، حدد وضع الاصطدام وأدخل طاقة الاصطدام ، أو قيمة CE. اضبط نطاق فحص MS / MS. انقر فوق حفظ لتسجيل طريقة MS وأدخل اسم ملف جديد في جدول التسلسل.

انقر فوق الزر “ابدأ” لبدء اكتساب MS / MS. بمجرد اكتمال الاستحواذ ، انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الخام في Explorer لتحميل ملف MS / MS الخام في برنامج معالجة البيانات. حدد أقوى أيون شظية في الطيف وأدخل قيمة m/z الخاصة به في قائمة أسلوب MSn.

في جدول إعداد MSn، قم بتعيين معلمات MS3، بما في ذلك وضع التعارض وقيمة CE ونطاق المسح الضوئي. مرة أخرى ، انقر فوق حفظ لتسجيل طريقة MS وأدخل اسم ملف جديد في جدول التسلسل. انقر فوق ابدأ لبدء اكتساب MS3.

كما هو موضح من قبل ، انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الخام في Explorer لتحميل ملف MS3 raw في برنامج معالجة البيانات ، وكرر الخطوات للحصول على طيف MS4. لتحليل البيانات ، انقر نقرا مزدوجا فوق الملفات الأولية لفتح جميع أطياف الكتلة من MS إلى MSn. احسب يدويا قيم الفرق m / z بين الأيون وأيونات الشظايا المقابلة.

بعد ذلك ، ارسم الهيكل الأساسي يدويا وفقا لنتائج MS4 واشتق البنية الأصلية باستخدام مجموعات وظيفية أو مقاطع جزيئية بناء على قيمة فرق m / z. ارسم مسارات الانقسام الجزيئي يدويا وفقا لكل بنية جزيئية في MSn. أنتج ESI-MS لنموذج سيلوبيوز الكربوهيدرات الجزيء البروتيني M H عند m / z 365 في الوضع الإيجابي.

أدى المسح الأيوني للمنتج ، أو CID MS / MS إلى أيون شظية ثان عند m / z 305. علاوة على ذلك ، أدى تحليل MS3 و MS4 بالتتابع إلى أيونات الشظايا الثالثة والرابعة عند m / z 254 و m / z 185 ، على التوالي. كشف تحليل MS / MS عن تسلسل شظايا الأيونات ، وهي التحلل المائي لفتح الحلقة ، وانقسام CC ، والجفاف.

لذلك ، تم العثور على هذه الطريقة مناسبة للكربوهيدرات. كشف التحليل النوعي الأولي ل AMS باستخدام LC Q-TOF MS عن وجود العديد من المركبات غير المعروفة. أنتج تحليل MSn السلبي لأيون M H عند m / z 617 أيون شظية ثان عند m / z 571.

أنتج تحليل MS3 لأيون الشظية هذا أيون شظية ثالث عند m / z 525 عن طريق فقدان هيدروكسي إيثيل كميثانول يتوافق مع 32 دالتون وهيدروكسيل كماء ، وهو 18 دالتون. أنتج تحليل MS4 أيونات شظايا رابعة عند m / z 344 و 273. كشف التحديد اليدوي للبنية الأساسية عن التركيب الجزيئي للمركب عند m / z 617 ومسارات انقسامه في MSn.

تم إجراء مسح أيون المنتج لأيون M H لمركب آخر غير معروف ، كما تم الكشف عن تركيبه الجزيئي وآلية الانقسام. بعد تشغيل مضخة التفريغ ، انتظر لمدة خمس ساعات على الأقل لضمان درجة فراغ كافية للظروف التجريبية. يمكن استخدام التحليل الإحصائي لتجميع الأجزاء التي لها نفس نسبة الكتلة إلى الشحنة أو ما شابهها.

مع زيادة محلول قياس الطيف الكتلي ، يمكن أن تساعد هذه التقنية الباحثين في الحصول على مركبات أحدث في الأدوية الطبيعية.