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March 17, 2023
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Este método puede ayudar a los investigadores a analizar las estructuras de los compuestos de la medicina tibetana, especialmente los componentes del árbol. Puede proporcionar información sobre el estudio cualitativo del contenido de compuestos en medicina natural. La principal ventaja de esta técnica es que la precisión de la estructura compuesta obtenida en este caso es mayor que la de la base de datos.
Esta técnica se puede utilizar en el análisis de la estructura de los intermediarios metabólicos en la vejiga o la orina. Para comenzar, la medicina tibetana Abelmoschus manihot’s semillas muestra la preparación. Pesar con precisión un gramo de AMS y colocarlo en un matraz cónico que contenga 30 mililitros de 80% de metanol.
Usando un sonicador de baño de ultrasonido a 40 kilohercios, realice la extracción de la mezcla durante 30 minutos a 25 grados centígrados. Luego, centrifugar la muestra a 14, 000 g durante cinco minutos. Prepare una jeringa de inyección y un filtro de membrana microporosa orgánico de 0,22 micras, y filtre el sobrenadante en una botella de muestra de dos mililitros.
Después de encender el interruptor de la bomba de vacío, abra la válvula principal del cilindro de argón junto con la válvula de presión parcial y ajuste la presión a aproximadamente 0,3 megapascales. Luego, abra la válvula de nitrógeno. Inicie el software de control de espectrometría de masas, o MS.
Haga clic en Fuente ESI calentada en el panel de software y configure los parámetros MS, incluida la temperatura del calentador, los caudales de gas, el voltaje de pulverización para los modos positivo y negativo y la temperatura capilar. Haga clic en el botón Aplicar para activar la fuente de iones para cromatografía líquida o LC.Prepare las fases móviles A y B utilizando ácido fórmico al 0,1% en una solución acuosa en acetonitrilo puro, respectivamente. Desgasificarlos en un sonicador de baño de ultrasonido a 40 kilohercios durante al menos 15 minutos antes de conectar las soluciones a los pasajes de fluido A y B, respectivamente.
Prepare una solución de agua de metanol 1:9 volumen por volumen, luego llénela manualmente en las botellas de líquido de limpieza de la bomba y el inyector. Después de iniciar el software de control LC-MS, haga clic en Control directo para abrir el panel de control LC. Abra la válvula de purga en sentido contrario a las agujas del reloj en el módulo de la bomba.
Haga clic en Más opción para abrir la configuración de la bomba y establecer los parámetros de purga en cinco mililitros por minuto durante tres minutos. Haga clic en Purgar para iniciar la eliminación de burbujas. Una vez hecho esto, cierre la válvula de purga.
Luego, haga clic en Prime Syringe para enjuagar la jeringa durante tres ciclos, Wash Buffer Loop para enjuagar el bucle durante un ciclo y Wash Needle Externally para lavar la aguja durante un ciclo. Coloque el frasco de muestra en el muestrador. Haga clic en Configuración del instrumento para abrir la ventana de edición de métodos y haga clic en Nuevo para crear un nuevo método de instrumento LC-MS.
Establezca un tiempo de ejecución total para el método y establezca el límite de presión. Caudal total, gradiente de flujo, temperatura de muestra, temperatura de columna y delta de temperatura de preparación en la ventana Edición de métodos. Para el método MS, seleccione el tipo de experimento General MS o MSn.
Introduzca los valores del tiempo de adquisición, la polaridad, el rango de masa, el número de valor de desvío y la duración. Haga clic en Guardar para configurar los ajustes como un método de instrumento. Haga clic en Configuración de secuencia para abrir la tabla de secuencias, en la que ingrese la información sobre el tipo de muestra, archivo, nombre, ruta, ID de muestra, método del instrumento, posición y volumen de inyección.
Grabe la tabla de secuencias haciendo clic en Guardar, luego implemente la configuración e inicie la adquisición de MS. Para cargar los datos de MS en el software de procesamiento de datos, haga doble clic en el archivo sin procesar en Explorer. En el cromatograma de pico base BPI, seleccione el área máxima debajo de la curva o AUC haciendo clic y arrastrando el ratón.
El espectro MS correspondiente se mostrará en la misma ventana. Seleccione un ion objetivo para el siguiente análisis MS/MS. Vuelva a abrir la ventana Edición de métodos y, en la tabla de configuración de MSn, establezca el m/z del ion de destino en un decimal en la columna Misa principal.
A continuación, seleccione el modo de colisión e introduzca la energía de colisión o el valor CE. Establezca el rango de escaneo MS/MS. Haga clic en Guardar para grabar el método MS e ingrese un nuevo nombre de archivo en la tabla de secuencia.
Haga clic en el botón Inicio para iniciar la adquisición de MS / MS. Una vez completada la adquisición, haga doble clic en el archivo RAW en Explorer para cargar el archivo RAW MS/MS en el software de procesamiento de datos. Identifique el ion fragmento más fuerte del espectro e introduzca su valor m/z en la lista de métodos MSn.
En la tabla de configuración de MSn, defina los parámetros MS3, incluido el modo de colisión, el valor CE y el rango de escaneo. Nuevamente, haga clic en Guardar para grabar el método MS e ingrese un nuevo nombre de archivo en la tabla de secuencia. Haga clic en Iniciar para iniciar la adquisición de MS3.
Como se demostró anteriormente, haga doble clic en el archivo sin formato en el Explorador para cargar el archivo sin formato MS3 en el software de procesamiento de datos y repita los pasos para obtener el espectro MS4. Para analizar los datos, haga doble clic en los archivos sin procesar para abrir todos los espectros de masas de MS a MSn. Calcule manualmente los valores de diferencia m/z entre el ion y los iones de fragmento correspondientes.
Luego, dibuje manualmente la estructura del núcleo de acuerdo con los resultados de MS4 y derive la estructura original utilizando grupos funcionales o segmentos moleculares basados en el valor de diferencia m / z. Dibuje manualmente las trayectorias de escisión molecular de acuerdo con cada estructura molecular en MSn. El ESI-MS de la celobiosa de carbohidratos modelo produjo la molécula proteinada M H a m/z 365 en modo positivo.
El escaneo iónico del producto, o CID MS/MS dio como resultado un segundo fragmento de ion en m/z 305. Además, el análisis MS3 y MS4 resultó secuencialmente en el tercer y cuarto fragmento de iones en m/z 254 y m/z 185, respectivamente. El análisis MS / MS reveló la secuencia de fragmentaciones de iones, a saber, hidrólisis de apertura de anillo, escisión de CC y deshidratación.
Por lo tanto, este método se encontró adecuado para los carbohidratos. El análisis cualitativo preliminar de AMS utilizando LC Q-TOF MS reveló la presencia de numerosos compuestos desconocidos. El análisis negativo de MSn del ion M H en m/z 617 produjo un segundo fragmento de ion en m/z 571.
El análisis MS3 de este fragmento de ion produjo un tercer fragmento de ion a m/z 525 por la pérdida de hidroxietilo como metanol correspondiente a 32 dalton e hidroxilo como agua, que es 18 dalton. El análisis MS4 produjo iones de cuarto fragmento en m/z 344 y 273. La identificación manual de la estructura del núcleo reveló la estructura molecular del compuesto en m/z 617 y sus trayectorias de escisión en MSn.
Se realizó el escaneo iónico producto del ion M H de otro compuesto desconocido, y también se reveló su estructura molecular y mecanismo de escisión. Después de encender la bomba de vacío, espere al menos cinco horas para garantizar un grado de vacío suficiente para las condiciones experimentales. El análisis estadístico se puede utilizar para cotejar los fragmentos que tienen la misma o similar relación masa-carga.
Con el aumento de la solución de espectrometría de masas, esta técnica podría ayudar a los investigadores a obtener compuestos más nuevos en medicinas naturales.
Aquí, describimos un protocolo general y un diseño que podría aplicarse para identificar trazas y componentes menores en las complejas formulaciones de productos naturales (matrices) en la medicina tibetana.
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Fu, X., Pan, Y., Wang, Y., Pei, Z., Xu, B., Zhang, J., Su, J. Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis. J. Vis. Exp. (193), e65054, doi:10.3791/65054 (2023).
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