Стандартизированная идентификация структуры соединений в тибетской медицине с использованием масс-спектрометрии ионных ловушек и многоступенчатого фрагментационного анализа

Этот метод может помочь исследователям проанализировать структуру соединений тибетской медицины, особенно компонентов дерева. Это может дать представление о качественном изучении содержания соединения в натуральной медицине. Основное преимущество данной методики заключается в том, что точность полученной в этом случае составной структуры выше, чем у базы данных.

Этот метод может быть использован при анализе структуры метаболических промежуточных продуктов в мочевом пузыре или моче. Для начала тибетская медицина Abelmoschus manihot’s пробы подготовила образцы. Точно взвесьте один грамм AMS и поместите его в коническую колбу, содержащую 30 миллилитров 80% метанола.

Используя ультразвуковой аппарат для ультразвуковой ванны с частотой 40 килогерц, выполните экстракцию смеси в течение 30 минут при температуре 25 градусов по Цельсию. Затем центрифугируйте образец при 14 000 г в течение пяти минут. Подготовьте инъекционный шприц и органический микропористый мембранный фильтр размером 0,22 микрона, а также отфильтруйте надосадочную жидкость в двухмиллилитровую бутылку для образцов.

После включения выключателя вакуумного насоса откройте главный клапан баллона с аргоном вместе с клапаном парциального давления и отрегулируйте давление примерно до 0,3 мегапаскаля. Затем откройте азотный клапан. Запустите управляющее программное обеспечение масс-спектрометрии или MS.

Нажмите «Источник ESI с подогревом» на панели программного обеспечения и установите параметры MS, включая температуру нагревателя, расход газа, напряжение распыления для положительного и отрицательного режимов и температуру капилляров. Нажмите кнопку «Применить», чтобы активировать источник ионов для жидкостной хроматографии или LC.Подготовьте подвижные фазы A и B, используя 0,1% муравьиной кислоты в водном растворе в чистом ацетонитриле соответственно. Дегазируйте их в ультразвуковой ванне на частоте 40 килогерц в течение не менее 15 минут, прежде чем подключать растворы к жидкостным каналам A и B соответственно.

Приготовьте раствор метанольной воды в соотношении 1:9 по объему, затем вручную залейте его в бутылки с очищаемой жидкостью насоса и инжектора. После запуска управляющего программного обеспечения LC-MS нажмите Direct Control, чтобы открыть панель управления LC. Откройте продувочный клапан против часовой стрелки на модуле насоса.

Нажмите «Дополнительная опция», чтобы открыть настройку насоса и установить параметры продувки на уровне пяти миллилитров в минуту в течение трех минут. Нажмите «Очистка», чтобы начать удаление пузырьков. После этого закройте продувочный клапан.

Затем нажмите «Основной шприц», чтобы промыть шприц в течение трех циклов, «Буферная петля для стирки», чтобы промыть петлю в течение одного цикла, и «Игла для внешней стирки», чтобы промыть иглу в течение одного цикла. Поместите бутылку с образцом в пробоотборник. Нажмите «Настройка инструмента», чтобы открыть окно редактирования метода, и нажмите «Создать», чтобы создать новый метод инструмента LC-MS.

Установите общее время выполнения метода и установите предел давления. Общий расход, градиент потока, температура образца, температура колонны и дельта температуры готовности в окне редактирования метода. Для метода MS выберите тип эксперимента General MS или MSn.

Введите значения времени захвата, полярности, диапазона масс, номера значения отклонения и продолжительности. Нажмите «Сохранить», чтобы настроить параметры в качестве инструментального метода. Нажмите «Настройка последовательности», чтобы открыть таблицу последовательности, в которой введите информацию о типе образца, файле, имени, пути, идентификаторе образца, методе прибора, положении и объеме впрыска.

Запишите таблицу последовательностей, нажав кнопку «Сохранить», затем выполните настройки и инициируйте сбор MS. Чтобы загрузить данные MS в программное обеспечение для обработки данных, дважды щелкните необработанный файл в проводнике. В базовой пиковой хроматограмме BPI выберите максимальную площадь под кривой или AUC, щелкнув и перетащив мышь.

Соответствующий спектр MS будет отображаться в том же окне. Выберите ион-мишень для следующего анализа МС/МС. Снова откройте окно редактирования метода и в таблице настроек MSn установите m/z целевого иона на один десятичный знак в столбце «Родительская масса».

Затем выберите режим столкновения и введите энергию столкновения или значение CE. Установите диапазон сканирования MS/MS. Нажмите «Сохранить», чтобы записать метод MS и ввести новое имя файла в таблицу последовательностей.

Нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать приобретение MS/MS. После завершения сбора дважды щелкните необработанный файл в проводнике, чтобы загрузить необработанный файл MS / MS в программное обеспечение для обработки данных. Определите самый сильный фрагментный ион в спектре и введите его значение m/z в список методов MSn.

В таблице настроек MSn задайте параметры MS3, включая режим столкновения, значение CE и диапазон сканирования. Снова нажмите «Сохранить», чтобы записать метод MS и ввести новое имя файла в таблицу последовательностей. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать получение MS3.

Как было показано ранее, дважды щелкните необработанный файл в проводнике, чтобы загрузить необработанный файл MS3 в программное обеспечение для обработки данных, и повторите шаги, чтобы получить спектр MS4. Чтобы проанализировать данные, дважды щелкните необработанные файлы, чтобы открыть все масс-спектры от MS до MSn. Вручную рассчитайте значения разницы m/z между ионом и соответствующими ионами-фрагментами.

Затем вручную нарисуйте структуру ядра в соответствии с результатами MS4 и получите исходную структуру, используя функциональные группы или молекулярные сегменты на основе значения разности m/z. Вручную нарисуйте пути молекулярного расщепления в соответствии с каждой молекулярной структурой в MSn. ESI-MS модельной углеводной целлобиозы продуцировал белковую молекулу M H при m/z 365 в положительном режиме.

Сканирование ионов продукта, или CID MS/MS, привело к получению второго фрагмента иона при m/z 305. Кроме того, анализ MS3 и MS4 последовательно привел к получению третьего и четвертого фрагментов ионов при m/z 254 и m/z 185 соответственно. Анализ MS/MS выявил последовательность фрагментации ионов, а именно гидролиз раскрытия кольца, расщепление CC и обезвоживание.

Так, этот метод был признан подходящим для углеводов. Предварительный качественный анализ ВМС с использованием ЖК Q-TOF MS выявил наличие многочисленных неизвестных соединений. Отрицательный MSn-анализ иона M H при m/z 617 произвел второй фрагмент иона при m/z 571.

Анализ MS3 этого фрагментированного иона произвел третий фрагмент иона при m/z 525 за счет потери гидроксиэтила в виде метанола, соответствующего 32 дальтонам, и гидроксила в виде воды, что составляет 18 дальтон. Анализ MS4 произвел четвертые фрагменты ионов на m/z 344 и 273. Ручная идентификация структуры ядра выявила молекулярную структуру соединения в m/z 617 и пути его расщепления в MSn.

Было проведено сканирование продукта иона M H другого неизвестного соединения, а также выявлена его молекулярная структура и механизм расщепления. После включения вакуумного насоса подождите не менее пяти часов, чтобы обеспечить достаточную степень вакуума для экспериментальных условий. Статистический анализ может быть использован для сопоставления фрагментов, имеющих одинаковое или похожее отношение массы к заряду.

С увеличением количества решений для масс-спектрометрии этот метод может помочь исследователям получить новые соединения в природных лекарствах.