Retina Yatay Dilim Hazırlık

Published 11/20/2006
2 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Geleneksel dikey dilim ve retinanın tüm hazırlık retina devrelerin fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Burada, sağlam retina nöronların dendritik morfoloji korumak için yöntem dilimleme roman açıklar.

Cite this Article

Copy Citation

Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal Slice Preparation of the Retina. J. Vis. Exp. (1), e108, doi:10.3791/108 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Geleneksel dikey dilim ve retinanın tüm hazırlık retina devrelerin fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Ancak, amacrine hücreleri gibi retinal nöronların, hücrelerin morfolojisi dikey dilimler halinde ağır hasarlı olması gerekiyordu ki, yatay dendritler genişletmek. Bütün montaj hazırlanmasında, özellikle yama klemp kayıtları için, orta tabaka retina nöronlar glial hücre (Müller hücre) ler endfeets geniş kapsama alanı nedeniyle kolayca erişilebilir değildir. Burada, sağlam retina nöronların dendritik morfoloji korumak için yöntem dilimleme roman açıklar. Retina düşük sıcaklık erime agaroz jel gömülü sonra dilim vibratome dilimleme makinesi kullanarak retinanın iç tabakası yatay olarak yapılmıştır. Retinanın bu yatay dilim hazırlanmasında, yama klemp kayıt, kalsiyum görüntüleme tekniği, immünhistokimya ve RT-PCR tek hücreli kullanarak, kendi morfolojisi ile karşılaştırıldığında retinal nöronların fonksiyonu okudu.

Protocol

  1. Agar bloğu (30 mg / ml, yani% 3, distile su) hazırlayın. Çözülür ve mikrodalga ilk ve bir cam tabak içine dökün. 4 ° C'de buzdolabında çanak tutun
    İpucu: agar blok önceden hazırlanmış olmalıdır.

  2. Hazırlayın düşük sıcaklık eritme agaroz jel (orta, 25 mg / ml, yani% 2,5 'i,). Çözülür ve mikrodalga. 35 ° C'de sıcak su banyosunda tutun
    İpucu: agaroz jel çok sıcak NOT tutun. Çok sıcak ise, bu katılaşmış olması için uzun bir süre alır ve jel retinanın öldürebilir

    .
  3. Hayvan, aydınlatmak bir göz küresi Euthanize ve Göz yuvası gibi açın. Vitreus mizah sıvılaştırılması için açılan Göz yuvası varsa mutlaka orta hiyalüronidaz 10 dakika (0.07 mg / ml) için ıslatılır.

  4. Agar (örn., 1 cm x 1,5 cm fare retina) bir blok halinde kesin ve anında yapıştırıcı vibratome bir sahnede sıkıca bağlı. Agar bloğu ıslak tutun.

  5. Dilimleme makinesi az 5 derece bıçak yerleştirin. Yaklaşık hızda agar bloğu üst yüzeyi hafifçe kesti. 50 mm / sn, frekans. 50 Hz.
    İpucu: agar blok üst yüzeyi tamamen düz ve pürüzsüz olduğundan emin olun. Bazı kesim (en az 3 kez), agar bloğu, pürüzsüz ve düz bir yüzey elde etmek için gerekli olabilir
    .

  6. Göz yuvası hiyalüronidaz olmadan orta ile durulayın. Retina pigment epitel izole etmek ve bir parça filtre kağıdı üzerinde fotoreseptör-tarafı aşağı yerleştirin. Filtre kağıdı sıkıca retina eklemek için, filtre kağıdı birkaç kez retina vakum.
    İpucu: retina tamamen düz filtre kağıdı takılı olduğundan emin olun. Filtre kağıdı üzerinde bir retina koymak sonra, retina (Fig.2A) çevreleyen fazla filtre kağıdı kesti. Fazla filtre kağıdı, genellikle uygun retina tabakası girecek bir bıçak önler .

  7. Agar bloğu aşırı orta yavaşça silin ve agar blok dikkatlice filtre kağıdı retina. Agar blok filtre kağıdı sıkıca yerleştirmek için, filtre kağıdı kenarına anında yapıştırıcı takın.
    İpucu: agar blok üst yüzeyi mümkün olduğunca ön unexpectable çatlak önlemek için, retinanın yerleştirin.

  8. Düşük sıcaklıkta eriyen agaroz jel retinanın üzerine yavaşça dökün. 1 dakika bekleyin ve yavaşça soğumasını orta dökün. Agaroz jel hızlı katılaşmış olur.
    İpucu: Çok sıcak agaroz jel retinanın öldürür.

  9. Agar bloğun üst yüzeyinden birkaç yüz mikron bıçak pozisyonu kaldırın ve yavaşça katılaşmış agaroz jel üst kesim.

  10. Bıçak konum aşağı indirin. Retinanın iç nükleer tabaka (yaklaşık agar bloğun üst yüzeyinden 200 ila 250 mikron) proksimal üçte biri düzeyinde kesin.
    İpucu: Çok fazla bıçak hızı ciddi retina zarar verecektir. Yaklaşık. 50 mm / sn (50 Hz) uygun olur.

  11. Amacrine hücreleri artık yüzü aşağı olduğuna dikkat edin. Dikkatle katılaşmış agaroz jel ile birlikte retina dilim pick up ve yüzü yukarı bir oda ya da bir tabak içinde yerleştirin.
    İpucu: Fare retinanın küçük ve dalgalı olduğu için, mükemmel bir yatay dilim uygun bir tabaka elde etmek zordur. Bir "eğik" dilim retinanın göreceli düz bir dilim almak için alternatif bir yöntem olabilir . Eğik dilim almak için, filtre kağıdı ve agar bloğu olarak Fig.2B gösterilen retina arasında başka bir filtre kağıdı koyun . Amacrine hücre soma dilim yüzeyinde bazı alanlarda mükemmel bir yatay dilim bekleyemezsiniz rağmen, her zaman vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Retinanın yatay dilim hazırlık birçok önemli avantajları vardır.

İlk olarak, amacrine hücreleri ve yatay hücreleri gibi, yatay dendritler genişletmek hücrelerin morfolojisi, korunur. Bu hücrelerinin morfolojisi fizyolojik özelliği ile karşılaştırmak için oldukça önemlidir, böylece 20 farklı tipte (MacNeil ve Masland, 1998), retina amacrine hücreleri üzerinde olduğu kanıtlanmıştır.

İkincisi, tüm montaj retinada, glial hücre s endfeets geniş kapsama alanı, yama pipetler erişim amacrine hücreleri engeller. Amacrine hücrelerinin soma yatay dilim, dilim yüzeye maruz kalmaktadır.

Üçüncü olarak, bu dilim yüzeyinde bulunması nedeniyle kimyasal reaktifler kolayca hedef hücreleri ve dendritler ulaşabilirsiniz. Yıkama ve wash-out kimyasalların hızlı ve kolay.

Dördüncüsü, bu tür geleneksel kalsiyum görüntüleme gibi floresan iyon görüntüleme performable. Geleneksel dikey dilimleri ya da tüm montaj retinanın görüntüleme kendisi için uyarma ışık fotoreseptörlerin harekete geçirir. Uyarma kirlenme ışık uyarılmış eserler olacak şekilde yatay dilim hazırlama, fotoreseptör ve photopigments tamamen kaldırılır. Fotoreseptörlerin arka plan aktivitesi ortadan kalkar Bunun yanı sıra, görüntüleme sinyal-gürültü oranı çok daha yüksektir. Yatay kesit hazırlanması en büyük dezavantajı, fotoreseptör ve ganglion hücreleri arasında dikey bağlantı, dilim içinde herhangi bir görsel bilgi işlem olduğunu kesilir.

Bu teknik, retinaya goldfish, fare ve tavşan (Fig.1B) gibi herhangi bir standart hayvanların uygulanabilir. Yatay dilim yöntemi, nöronlar ve retina sinir devreleri fonksiyonu soruşturmada alternatif bir yol sunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm deneysel protokolleri hayvan kullanımı için sağlık kuralları National Institutes göre yapılmıştır.

Acknowledgements

Biz Dr teşekkür ederim. Retinanın yatay dilim hazırlama prosedürü kurmak için bize değerli tavsiyeleri ve önerileri veren Richard H. Masland ve Akimichi Kaneko.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A-1296
Agarose L Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 317-01182 Low-temperature melting agarose
Hyaluronidase Sigma-Aldrich Type I-S, 300 U/mg
Medium in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma)
Microwave
Hot water bath 35 °C
Vibratome slicer Leica Microsystems VT1000S
MF-Membrane filters EMD Millipore HAWP01300 Filter paper , pore size 0.45 µm
Dissection tools forceps, blade, pinch, twizzer, etc.
Instant glue e.g. Alonalpha, Krazy Glu
50 ml Syringe
Syringe filter EMD Millipore SX0001300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. 64-73 (2004).
  2. Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. 328-340 (2004).
  3. MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 971-982 (1998).

Comments

2 Comments

  1. Hi, I was wondering if it is possible to prepare coronal sectinos while keeping tissue on the filetr as you have described? Will the blade cut through the filter paper without mechanically dmaaging the tissue? I think of cutting flat olfactory epithelium ini such a way. thanks Kirill

    Reply
    Posted by: Kirill Ukhanov u.
    June 18, 2008 - 9:49 AM
  2. where are the figures you are refering to in the text???

    Reply
    Posted by: Arndt M.
    October 19, 2010 - 10:32 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats