Ensaios Neurocircuit para Apreensões em mutantes de Epilepsia Drosophila

Biology

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Summary

Usando de alta freqüência, estimulação elétrica, a atividade de apreensão-como pode ser induzida em

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Howlett, I. C., Tanouye, M. A. Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila. J. Vis. Exp. (26), e1121, doi:10.3791/1121 (2009).

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Abstract

Drosophila melanogaster é uma ferramenta útil para estudar como a apreensão de atividade. Uma variedade de mutantes em que as convulsões podem ser induzidas, quer através de choque físico ou estimulação elétrica está disponível para o estudo de vários aspectos da atividade epiléptica e comportamento. Todas as moscas, inclusive do tipo selvagem, serão submetidos a atividades do tipo convulsivas se estimulado a uma tensão alta o suficiente. Apreensão como a atividade é uma resposta do tudo ou nada e cada genótipo tem um limiar de convulsão específico. O limiar convulsivo de um genótipo específico da mosca pode ser alterada, quer por tratamento com uma droga ou pela supressão genética ou acessório. O limiar é facilmente medido por eletrofisiologia. Apreensão-como a atividade pode ser induzida através da estimulação de alta freqüência elétrica entregues diretamente para o cérebro e registrados através dos músculos dorsal longitudinal (DLMS) no tórax. O DLMS são inervados por parte do sistema de fibra gigante. Começando com a estimulação de baixa tensão, alta freqüência e, posteriormente, aumentando a tensão em pequenos incrementos, o limiar de convulsão para uma única mosca pode ser medido.

Protocol

Preparação de amostras:

A noite antes do experimento, as moscas machos do genótipo desejado são anestesiados e colocados em um frasco com um plugue de nylon macia. A bola de algodão também funcionaria. Após anestesiados, o limiar de convulsão é alterado, para que as moscas são deixadas por pelo menos 6 horas, embora durante a noite é ideal.

No dia do experimento, as moscas são montados um de cada vez para lâminas de vidro com uma camada de cera dental em um lado.

A única mosca é captado pela cabeça usando uma agulha de calibre 23 (com a ponta afiada corte) ligado a uma linha de vácuo.

A mosca é então aposta a cera no slide, empurrando as pernas e asas para a cera.

Uma vez que a mosca é imobilizada, a cera é empurrado para cima ao redor do pescoço e os olhos inteiramente imobilizar a cabeça.

Eletrofisiologia:

A mosca, que agora está montado e pronto para ir é colocada na eletrofisiologia configurar.

O conjunto de eletrofisiologia up é composto por três conjuntos de micromanipuladores, cada um com 1-2 eletrodos de tungstênio afiadas anexado. Tensão é fornecida por um estimulador que é conectado a uma unidade de isolamento ligados aos eletrodos de estimulação. O eletrodo de gravação é conectado a um pré-amplificador que por sua vez está ligado a um osciloscópio de armazenamento digital. Embora não seja essencial, é útil ter um alto-falante ligado ao osciloscópio de modo que as respostas podem ser feitas audível.

Um eletrodo terra é inserida no abdômen da mosca.

O eletrodo de registro é inserido em um dos músculos dorsais longitudinais no tórax da mosca.

Os eletrodos estimulantes são inseridos na cabeça. Um ao lado de cada olho.

O estimulador deve ter as seguintes configurações para começar: intervalo de pulso contínuo com 2 segundos entre cada pulso. Não deve haver nenhum atraso de pulso. A largura de pulso deve ser 0,2 ms.

O osciloscópio deve ter o recurso de armazenamento ligado e ter as seguintes configurações: Tempo / DIV deve ser definido como 1ms/DIV. Volts / DIV deve ser definido em cada 0.1V/DIV ou 50 mV / DIV.

O limiar de fibra gigante é determinada através da apresentação de pulsos simples e notando a tensão mínima necessária para obter uma resposta. Esta tensão é normalmente em torno de 2 V.

Uma vez que o limiar de fibra gigante foi determinado, pare de pulsar a voar e alterar as configurações do osciloscópio: 0,2 S / DIV

As definições sobre o estimulador deve ser alterado para: O intervalo de pulso deve ser definido como único. O trem deve ser ligado e ajustado para 3 segundos. Os parâmetros de forma de onda são: 0,5 ms em 200 Hz pulsos para 300 ms. A tensão é alterada para a configuração desejada e um trem de alta freqüência dos pulsos é entregue ao cérebro da mosca.

Se uma convulsão não é induzido, o traço do osciloscópio irá mostrar uma linha reta depois que o trem. Se as configurações estiverem definir rapidamente de volta para as configurações de partida, os pulsos só irá causar uma resposta no sistema de fibra gigante.

Se um ataque é induzida, o osciloscópio irá mostrar a atividade de apreensão-como depois que o trem. Se as configurações são rapidamente voltou para as configurações originais, os pulsos só deixará de ativar uma resposta no sistema de fibra gigante.

As moscas têm um período refratário depois de um wavetrain estímulo de alta freqüência na qual apreensão como a atividade não pode ser induzido. Se nenhuma apreensão ocorre as moscas são refratários por aproximadamente 7 minutos. Se um ataque é induzida, as moscas têm um período refratário de aproximadamente 17 minutos.

Ao determinar o limiar, adicional de alta frequência estímulos podem ser entregues à mosca mesmo (após o momento adequado para o período refratário), até o limite é determinado ou até que a resposta de fibra gigante torna-se fraco demais para ver.

Após o experimento é completado, a mosca é removido da eletrofisiologia set up, lançado a partir da cera, e eliminados.

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Discussion

Este vídeo demonstra os passos básicos para determinar o limiar convulsivo de uma mosca Drosophila individual. Em vez de usar o osciloscópio digital, um digitalizador informatizado pode também ser usado. Esta técnica é útil para determinar os efeitos de uma droga ou alteração genética no limiar apreensão de uma mosca.

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Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma pesquisa NIH concessão, uma doação da Fundação de Epilepsia e um subsídio da Fundação McKnight Experimentos com moscas Drosophila MT frutas foram realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Comissão Use UC Berkeley Animal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital oscilloscope Hitachi VC-6523
Stimulator Cornerstone S-900
Preamplifier World Precision Instruments, Inc. Electro 705
Micromanipulators Narishige International various

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References

  1. Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
  2. Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
  3. Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).

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