Saggi Neurocircuit per Sequestri in mutanti di Epilessia Drosophila

Biology

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Summary

Utilizzando la stimolazione elettrica ad alta frequenza, il sequestro-simile può essere indotta a

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Howlett, I. C., Tanouye, M. A. Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila. J. Vis. Exp. (26), e1121, doi:10.3791/1121 (2009).

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Abstract

Drosophila melanogaster è un utile strumento per studiare come il sequestro di attività. Una varietà di mutanti in cui crisi epilettiche possono essere indotte attraverso uno shock fisico o stimolazione elettrica è disponibile per lo studio di vari aspetti della crisi e del comportamento. Tutte le mosche, compreso wild-type, saranno sottoposti a sequestro un'attività simile, se stimolato con una tensione abbastanza alta. Sequestro come attività è una risposta tutto-o-niente e ogni genotipo ha una determinata soglia convulsiva. La soglia di sequestro di un genotipo specifico di volo può essere alterata mediante trattamento con un farmaco o dalla soppressione o il miglioramento genetico. La soglia può essere facilmente misurato con elettrofisiologia. Sequestro un'attività simile può essere indotta attraverso la stimolazione ad alta frequenza elettrica erogata direttamente al cervello e registrato attraverso i muscoli dorsali longitudinali (DLMS) nel torace. Il DLMS sono innervati dal parte del sistema di fibra gigante. A partire da bassa tensione, la stimolazione ad alta frequenza, e di conseguenza aumentare la tensione con piccoli incrementi, la soglia convulsiva per una sola mosca può essere misurata.

Protocol

Preparazione del campione:

La notte prima dell'esperimento, le mosche maschio del genotipo desiderati sono anestetizzati e collocato in una fiala con un tappo in nylon morbido. Un batuffolo di cotone potrebbe anche funzionare. A seguito di anestesia, la soglia convulsiva è alterata, per cui le mosche è meglio lasciarle per almeno 6 ore, anche se durante la notte è l'ideale.

Il giorno dell'esperimento, le mosche sono montati uno alla volta alle diapositive di vetro con uno strato di cera dentale su un lato.

Una mosca singolo viene prelevato dalla testa utilizzando un ago di 23 gauge (con la punta affilata tagliare) collegato ad una linea di vuoto.

La mosca è poi apposta la cera sulla diapositiva premendo le zampe e le ali nella cera.

Una volta che la mosca è immobilizzato, la cera è spinto verso l'alto intorno al collo e gli occhi per immobilizzare completamente la testa.

Elettrofisiologia:

La mosca, che ora è montato e pronto a partire si trova nel elettrofisiologia creato.

Il set di elettrofisiologia è composto da tre serie di micromanipolatori, ciascuno con uno o due elettrodi di tungsteno affilato allegato. La tensione è fornita da uno stimolatore che è collegato ad una unità di isolamento collegato agli elettrodi stimolanti. L'elettrodo di registrazione è collegato ad un pre-amplificatore che a sua volta è collegato a un oscilloscopio a memoria digitale. Anche se non è indispensabile, è utile avere un altoparlante collegato all'oscilloscopio in modo che le risposte possono essere resa udibile.

Un elettrodo viene inserito nell'addome della mosca.

L'elettrodo di registrazione è inserito in uno dei muscoli dorsali longitudinali nel torace della mosca.

Gli elettrodi stimolanti sono inseriti nella testa. Uno a fianco di ciascun occhio.

Lo stimolatore deve avere le seguenti impostazioni per iniziare: intervallo continuo impulso di 2 secondi tra ogni impulso. Non ci dovrebbero essere ritardi impulso. La larghezza degli impulsi deve essere 0,2 ms.

L'oscilloscopio deve avere la funzione di memorizzazione attiva ed hanno le seguenti impostazioni: Time / DIV deve essere impostato su 1ms/DIV. La Volt / DIV deve essere impostata sia a 0.1V/DIV o 50 mV / DIV.

La soglia di fibra gigante è determinato fornendo impulsi singoli e notando la tensione minima richiesta per ottenere una risposta. Questa tensione è tipicamente di circa 2 V.

Una volta che la soglia di fibra gigante è stata determinata, fermare pulsare al volo e modificare le impostazioni sull'oscilloscopio a: 0,2 s / div

Le impostazioni della stimolatore deve essere modificato in: L'intervallo di impulsi deve essere impostato su singolo. Il treno deve essere acceso e impostato su 3 secondi. I parametri della forma d'onda sono: 0,5 ms a impulsi di 200Hz per 300 ms. La tensione è cambiata l'impostazione desiderata e ad alta frequenza dei treni di impulsi viene consegnato al cervello della mosca.

Se il sequestro non è indotta, la traccia oscilloscopio mostra una linea piatta dopo che il treno. Se le impostazioni sono impostare rapidamente alle impostazioni di partenza, gli impulsi singolo causerà una risposta nel sistema di fibra gigante.

Se il sequestro è indotta, l'oscilloscopio visualizza il sequestro un'attività simile dopo che il treno. Se le impostazioni sono rapidamente ripristinata alle impostazioni originali, gli impulsi singolo mancherà di attivare una risposta nel sistema di fibra gigante.

Le mosche hanno un periodo refrattario dopo una alta frequenza wavetrain stimolo in cui il sequestro come attività non può essere indotta. Se non si verifica sequestro le mosche sono refrattari per circa 7 minuti. Se il sequestro è indotto, le mosche hanno un periodo refrattario di circa 17 minuti.

Nel determinare la soglia, ulteriori stimoli ad alta frequenza può essere consegnato al volo stesso (dopo il momento opportuno per il periodo refrattario) fino a quando la soglia è determinato o fino a quando la risposta fibra gigante diventa troppo debole per vedere.

Dopo l'esperimento è completato, il volo viene rimosso dal elettrofisiologia costituito, rilasciata dalla cera, e smaltiti.

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Discussion

Questo video ha dimostrato i passaggi fondamentali nel determinare la soglia di sequestro di una mosca drosofila individuale. Invece di usare l'oscilloscopio digitale, un digitalizzatore computerizzato può anche essere usato. Questa tecnica è utile per determinare gli effetti di un farmaco o di alterazione genetica sulla soglia sequestro di una mosca.

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Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da una ricerca NIH sovvenzione, una sovvenzione della Fondazione Epilessia McKnight e una sovvenzione della Fondazione per Esperimenti MT su moscerini della frutta Drosophila sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal Comitato di Animal Usa UC Berkeley.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital oscilloscope Hitachi VC-6523
Stimulator Cornerstone S-900
Preamplifier World Precision Instruments, Inc. Electro 705
Micromanipulators Narishige International various

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References

  1. Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
  2. Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
  3. Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).

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