Split-Ubiquitine membraanfilters op Yeast Two-Hybrid (mythe) Systeem: een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

MYTHE kan de gevoelige detectie van voorbijgaande aard en stabiele interacties tussen eiwitten die worden uitgedrukt in het model organisme Saccharomyces cerevisiae. Het is met succes toegepast op exogene en gist integrale membraaneiwitten bestuderen om hun interagerende partners in een high throughput manier te identificeren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Snider, J., Kittanakom, S., Curak, J., Stagljar, I. Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (36), e1698, doi:10.3791/1698 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De fundamentele biologische en klinische belang van integrale membraaneiwitten geleid tot de ontwikkeling van een gist-gebaseerd systeem voor de high-throughput identificatie van eiwit-eiwit interacties (PPI) voor de volledige lengte transmembraan eiwitten. Daartoe ons lab ontwikkelde de split-ubiquitine op basis van Membraan Yeast Two-Hybrid (mythe) systeem. Deze technologie maakt het mogelijk voor de gevoelige detectie van voorbijgaande aard en stabiele eiwit interacties met behulp van

Protocol

1. Achtergrond informatie

Eiwit-eiwit interacties (PPI) zijn de fundamentele bouwstenen die betrokken zijn in het bestuur van alle cellulaire processen. Bijgevolg is het essentieel dat alle interacties goed zijn gereguleerd om cellulaire homeostase te behouden, zoals een verschuiving in deze biologische evenwicht vaak een rol speelt bij de ziekte en kanker cel transformatie. Membraan geassocieerde eiwitten behoren tot de meest biologisch belangrijke klasse van eiwitten als zij kunnen starten complex signaleringscascades, en bemiddelen zowel de import en export van diverse moleculen, waaronder drugs, die van recente betekenis op het gebied van de gezondheidszorg is als problemen die verband houden met resistentie tegen geneesmiddelen zijn steeds vaker voor. Het verkrijgen van inzicht in de complexiteit van dit eiwit klasse vereist de identificatie van hun interagerende partners. Het ontdekken van deze partners heeft bewezen uitdagend, zoals vaak het vereist barre omstandigheden die moeten worden geoptimaliseerd voor elk membraan-gebonden eiwit [1].

De fundamentele biologische en klinische belang van integrale membraaneiwitten geleid tot de ontwikkeling van een gist-gebaseerd systeem voor de high-throughput identificatie van PPI voor full-length transmembraan eiwitten. Daartoe ontwikkelden we de split-ubiquitine op basis van Membraan Yeast Two-Hybrid (mythe) systeem [2-4]. Deze tool maakt het mogelijk voor de gevoelige detectie van voorbijgaande aard en stabiele eiwit interacties. Het is met succes toegepast op de exogene en endogene eiwitten die in het model organisme Saccharomyces cerevisiae [3-7]. Studeren MYTHE maakt gebruik van de vaststelling dat ubiquitine kunnen worden gescheiden in twee groepen:. De C-terminale helft (C ub) en de N-terminale helft (NubI) in vivo studies hebben aangetoond dat deze groepen spontaan reconstrueren vanwege hun hoge affiniteit voor een andere (Figure. 1a). Echter, de invoering van een isoleucine 13 tot en met glycine puntmutatie in de N-terminale helft van ubiquitine (produceren van een fragment aangeduid als N ub G) voorkomt deze spontane re-vereniging [8] (Figure. 1b).

Wij gebruiken dit principe in de MYTHE systeem (Figure. 1c en 2). Kortom, is het integraal membraan aas eiwit gefuseerd met een C ub groep die is gekoppeld aan een kunstmatige transcriptiefactor, bestaande uit de Escherichia coli DNA-bindend eiwit LexA en de activering domein van de VP16 van herpes simplex virus. Prooien worden gegenereerd door fusie van cDNA of genomische DNA-fragmenten afgeleid naar de NubG groep. Een interactie tussen aas en prooi eiwitten in een gist gastheer leidt tot herstel van 'pseudo-ubiquitine' een full-length molecuul, met de daaropvolgende erkenning door cytosolische enzymen ubiquitinerings (DUBS) en proteolytische release van de transcriptie factor. De transcriptiefactor kunt dan de kern van de cel, en activeer een reportergen-systeem (meestal met betrekking tot expressie van het HIS3, lacZ en ADE2 genen) waardoor de groei van de giststammen op selectieve media, die indicatief is voor aas en prooi interactie [ 2-4].

De identificatie en karakterisering van integraal membraan eiwit interacties zal informatie verstrekken om te helpen volledig te begrijpen van hun functie. Naarmate we meer in het bijzonder te begrijpen en ontleden de rol van de eiwitten die interageren met integrale membraaneiwitten, kunnen we inzicht in de dynamische wisselwerking die betrokken zijn bij de regulering van deze eiwitten en ontdekken nieuwe targets die therapeutisch potentieel zou kunnen hebben.

2. Selectie van Bait en passende MYTHE System

  1. Voorafgaand aan het uitvoeren van MYTHE analyse, controleer dan of uw eiwit zijn N-en / of C-terminus heeft in het cytosol van de cel. Het is essentieel dat de C ub-LexA-VP16 tag worden gefuseerd om uw proteïne op zo'n eindpunt, omdat de enzymen die nodig zijn voor de ubiquitinerings transcriptiefactor versie bevinden zich in het cytosol [4].
  2. Vervolgens beslissen welke van de twee belangrijke varianten van de mythe geschikt is. Voor niet-native gist eiwitten, kunnen de traditionele mythe (tMYTH) worden gebruikt, waarbij de aas ectopisch zijn overexpressie van een plasmide. Voor native gist eiwitten, geïntegreerde mythe (iMYTH) is de methode van keuze. In iMYTH aas zijn endogeen gelabeld met de C UB-LexA-VP16 tag, waardoor ze onder de controle van hun eigen promotor. Dit is voordelig, omdat de wild-type expressie van aas helpt bij het elimineren problemen in verband met eiwit overexpressie, zoals een toename van het aantal valse positieven [3]. Met uitzondering van de eerste aas constructie en de gebruikte selectieve media, zijn beide vormen van MYTHE uitgevoerd in een in wezen identieke wijze. Voor de duidelijkheid, zullen we ons richten zich vooral op het gebruik van tMYTH in dit rapport, omdat deze variant kan in principe worden gebruikt met membraaneiwitten vanuit vrijwel elk organisme en isdus meer breed toepasbaar.

3. Aas Generation en validatie

  1. Vereiste Media en oplossingen
    1. Steriele DDH 2 O bereid in de autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten.
    2. 3-amino-1 ,2,4-triazool (3-AT) oplossing bereid als een 1 M oplossing in voorraad DDH 2 O. Steriliseren door passage door een 0,2 um filter.
    3. YPAD Groei Media bestaande uit 1% w / v gistextract, 2% w / v pepton, 2% w / v glucose en 100 uM adenine bereid in DDH 2 O. Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten.
    4. 10x Amino Acid / Nucleotide Base Mix: Het complete mix bevat 1,0 mM Adenine, 1,8 mM Uracil, 1,0 mM Arginine, Histidine 1,0 mM, 2,3 mM Isoleucine, 7,6 mM leucine, 1,6 mM Lysine, 10,1 mM Methionine, 3,0 mM Fenylalanine, 16,8 mM threonine, 2,0 mM tryptofaan, 1,7 mM tyrosine en 12,8 mM Valine, opgesteld in DDH 2 O. Voor drop-out weg te laten de noodzakelijke aminozuur (s) en / of nucleotide base (s). Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten.
    5. Synthetische Drop-Out (SD) Groei Media bestaande uit 0,67% w / v yeast nitrogen base (zonder aminozuren, maar met ammoniumsulfaat), 2% w / v glucose, 2% w / v agar en 1x Amino Acid / Nucleotide Mix, bereid in DDH 2 O. Voor te bereiden zowel vloeibare als vaste (met 2% agar) SD-Leucine media. Ook voorbereiden op stevige SD-Tryptofaan-Leucine en SD-Tryptofaan-Leucine-Adenine-Histidine media. Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten. Giet vaste media in 100x15 mm petrischalen.
    6. Synthetische Drop-Out (SD) Groei media met 3-AT. Bereid SD-Tryptofaan-Leucine-Adenine-Histidine media, zoals beschreven, maar met 3-AT bij concentraties van 25, 50, 75 en 100 mm. Voeg de juiste hoeveelheid van 3-AT uit de 1M steriele voorraad oplossing voor de media nadat het is geautoclaveerd en gekoeld (maar nog niet gestold). Giet het mengsel in 100x15 mm petrischalen.
    7. PEG / Lithium Acetaat Mix bestaande uit 40% w / v PEG-3350, 120 mM Lithium acetaat en 167 ug / ml zalmsperma DNA (type III natriumzout) bereid in DDH 2 O. Om ervoor te zorgen dat de steriliteit van dit mengsel te bereiden uit steriel water en oplossingen (dat wil zeggen geautoclaveerd 50% PEG-3350, geautoclaveerd 1M Lithium acetaat en 2 mg / ml zalmsperma DNA type III natriumzout bereid in steriele DDH 2 O).
    8. Enzym en reagentia voor het uitvoeren van PCR.
    9. Commerciële Miniprep kit.
    10. Natronkalk glazen kralen (0,5 mm).
    11. Bevoegde Escherichia coli-cellen die geschikt zijn voor plasmide vermeerdering (bijvoorbeeld DH5a, XL10 goud) en standaard media die geschikt zijn voor bacteriële vermeerdering en plasmide selectie.
    12. Specifieke giststammen, plasmiden en primers, zoals beschreven in het protocol.
  2. Generatie van tMYTH Baits door Gap Repair
    1. Het aas moet worden gekloneerd in een geschikte vector voor tagging en expressie. Een verscheidenheid van tMYTH vectoren zijn op dit moment beschikbaar voor gebruik in aas bouw. Vectoren, zoals de pCMBV4, pAMBV4 en pTMBV4 laat de bouw van C-terminaal getagd aas (aas-C ub-LexA-VP16) onder de controle van de CYC1 (zwak), ADH1 (sterk) en TEF1 (zeer sterk) initiatiefnemers, respectievelijk . N-terminaal getagd aas (LexA-VP16-C ub-AAS) kan worden gegenereerd met behulp van vectoren zoals pTLB-1 en pBT3-N, onder de controle van de TEF1 en CYC1 initiatiefnemers, respectievelijk. De vector keuze hangt af van het aas en moet empirisch worden bepaald. In sommige gevallen hoger aas uitdrukking is nodig om interacties te detecteren, terwijl in andere gevallen aas overexpressie kan zelfs schadelijk zijn, wat leidt tot een toename van het aantal valse positieven.
    2. Beperking verteren de geselecteerde plasmide op de geschikte restrictie-site (s). Splitsing mag alleen plaatsvinden in de directe omgeving van de C UB-LexA-VP16 tag (stroomopwaarts van het label voor de C-terminale tagging of lager voor de N-terminale tagging). Bijvoorbeeld, wanneer het gebruik van de pAMBV4 vector, Sfil is een ideale keuze. Bewaar de verteerde plasmide bij -20 ° C tot klaar voor gebruik.
    3. Ontwerp van primers voor de amplificatie en het klonen van het gen van belang. Het 5 'einde van je voorwaartse primer moeten overeenkomen met ongeveer 35-40 nucleotiden stroomopwaarts van de restrictie site, terwijl het 3' einde moeten overeenkomen met de eerste 18 tot 20 nucleotiden van het target-gen. Het 5 'einde van de reverse primer moet overeenkomen met het omgekeerde complement van ongeveer 35-40 nucleotiden stroomafwaarts van de restrictie site, met het 3' uiteinde overeenkomt met de omgekeerde complement van de laatste 18 tot 20 nucleotiden van het target-gen (het weglaten van het stopcodon als de C ub-LexA-VP16 tag wordt geplaatst op de C-terminus). Afhankelijk van de vraag of N-of C-terminale tagging wordt uitgevoerd, selecteert u de 35-40 nucleotiden van de vooruit of achteruit primer zodanig dat het doel gen gekloond in frame met de C UB-LexA-VP16 tag.
    4. Amplify het gen van belang door middel van PCR met behulp van de bovenstaande primers. PCR-parameters zal afhangen van de specifieke enzym en de gebruikte specifieke primers.
    5. Transformeren het PCR-product samen met de verteerde plasmide in een geschikte gist lab stam met een leu2 mutatie (bijv. BY4741). Een mythe reporter stam (bijv. THY.AP4 of L40) kan worden gebruikt, maar is niet nodig, aangezien het doel van de gist op dit punt is gewoon om te dienen als een omgeving waarin het gat te repareren homologe recombinatie kan optreden. Transformatie moeten worden uitgevoerd als volgt:
      1. Inoculeren een kolonie van de door u geselecteerde giststam in 5 ml steriel YPAD media en 's nachts bij 30 ° C incuberen met constant schudden (200 rpm).
      2. Verdun het 's nachts cultuur in 50 ml vers YPAD media om een ​​OD600 van ~ 0,15 en incubeer bij 30 ° C onder schudden (200 rpm). Groeien voor ongeveer 3-4 uur totdat een OD600 van ~ 0,6 is bereikt.
      3. Centrifugeer de cellen op 700xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
      4. Resuspendeer de cel pellet in 25 ml steriele DDH 2 O en centrifugeer bij 700xg gedurende 5 minuten.
      5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 ml steriele DDH 2 O.
      6. Voeg 100 ul van de cellen, 300 ul PEG / Lithium Acetaat mix, en de verteerde plasmide (50 fmol) en PCR-product (250-500 fmol) om een ​​microfugebuis.
      7. Incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten.
      8. Heat shock bij 42 ° C gedurende 1 uur.
      9. Centrifugeer bij 3000xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
      10. Resuspendeer de cel pellet in 200 pi steriel DDH 2 O en de plaat het volledige volume op vaste, SD-Leucine selectieve media. Groeien bij 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
      11. Grow up een kolonie van de getransformeerde stam in 5 ml SD-Leucine vloeibare media bij 30 ° C gedurende de nacht.
      12. Centrifugeer cellen op 700xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
      13. Isoleer aas plasmide DNA van de cel pellets met behulp van een commercieel Miniprep kit. Volg het standaard protocol met een wijziging. Om voldoende gist cellysis zorgen, voeg een klein volume van 0,5 mm soda lime glazen kralen aan de pellet na de eerste resuspensie en vortex krachtig gedurende 5 minuten. Ga dan verder met de commerciële protocol als normaal.
      14. Transformeren geïsoleerde gist DNA in een competente E. coli stam die geschikt zijn voor plasmide vermeerdering (bijvoorbeeld DH5a, XL10 Gold) met een transformatie-efficiëntie van ten minste 1x10 7 cellen / ug DNA. Merk op dat aas plasmiden kunnen worden geselecteerd voor het gebruik van kanamycine.
      15. Oogst plasmide DNA uit de getransformeerde E. coli met behulp van een standaard-DNA-isolatie methode of commerciële kit.
      16. Controleer of de juiste constructie van het aas plasmide door sequentiebepaling.
      17. Transformeren de geverifieerde aas construct in een geschikt MYTHE reporter stam (bijv. THY.AP4, L40). De gist transformatie protocol zojuist beschreven kan worden gebruikt, vervangen door het aas plasmide DNA in plaats van de verteerd plasmide en PCR-product.
  3. Bait Validatie - Proper Localization
    1. Voorafgaand aan het gebruik, zijn aas stammen geanalyseerd om ervoor te zorgen dat ze goed zijn gelokaliseerd aan de gist membraan. Bij het gebruik van iMYTH, zal dit localisatie specifiek afhankelijk van de eigenschappen van het gelabelde aas. Voor tMYTH, aas plasmiden omvatten over het algemeen een signaalsequentie (bijv. Matα) de leiding van de tot expressie gebrachte eiwit naar de plasmamembraan. Lokalisatie wordt bepaald met behulp van fluorescentie microscopie. Opname van een YFP molecuul in het aas tag volgorde (dwz C UB-YFP-LexA-VP16) is de eenvoudigste en meest directe aanpak, waardoor directe visualisatie van levende cellen, en wordt vaak gebruikt in iMYTH. Als alternatief kan een standaard-benadering met behulp van immunofluorescentie antilichaam tegen de LexA of VP16 componenten van de tag worden gebruikt.
  4. Bait Validatie - N ub G / I Control Test
    1. Zodra de juiste lokalisatie van het aas is vastgesteld, is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het aas niet de reporter te activeren alleen of in de aanwezigheid van niet-interagerende prooien (dat wil zeggen controleren of het aas niet is zelfwerkend). Dit wordt bereikt met behulp van de N ub G / I Test, waar het aas is getransformeerd met interactie (positieve) en niet-interagerende (negatieve) controle prooien, en de groei is beoordeeld op selectieve media. Een aas moet groeien op selectieve media in van de aanwezigheid van de positieve controle, en niet groeien in de aanwezigheid van de negatieve controle, om geschikt te zijn voor gebruik in de mythe.
    2. Begin met het transformeren van de aas stam te worden getest met 100-200 ng van controle prooi plasmide. De eerder beschreven gist transformatie protocol kan worden gebruikt, vervangen door SD-Leucine media in plaats van YPAD en het gebruik van SD-Tryptofaan-Leucine media voor de laatste stap plating. De volgende controle prooi constructies worden vaak gebruikt:
      1. post1-N ub I (positieve controle)
      2. post1-N ub G (negatieve controle)
      3. pFUR4-N ub I (positieve controle)
      4. pFUR4-N ub G (negatieve controle)
    3. OST1 is een onderdeel van de oligosaccharyl complex en is gelokaliseerd in het endoplasmatisch reticulum membraan [9] terwijl FUR4 is een uracil permease en is gelokaliseerd in het plasmamembraan [10]. Hoewel deze eiwitten zijn over het algemeen onze eerste keuze voor gebruik als niet-interagerende prooien, zullen hun geschiktheid variëren op een geval per geval. In het onwaarschijnlijke geval dat uw aas wordt voorspeld om daadwerkelijk interactie met beide van deze controles, zullen alternatieve prooien moeten worden geselecteerd. Herinneren dat N UB I is de wild-type vorm van de N-terminus van ubiquitine, en spontaan interactie met C ub onafhankelijk van een interactie tussen de eiwitten waaraan de C en N ub ub zijn gesmolten. Zo N ub ik prooien vormen positieve controles, terwijl de N-ub G prooien (het dragen van de Isoleucine 13 tot en met Glycine mutatie die spontane associatie van N-en C-ub ub voorkomt) dienen als negatieve controles.
    4. Resuspendeer enkele kolonies van elk omgevormd aas in 100 il steriele DDH 2 O.
    5. Serieel verdund de geresuspendeerde cellen in steriele DDH 2 O tot verdunningen van 1 / 10, 1 / 100 en 1 / 1000 te produceren.
    6. Spot 5 pi volumes onverdund en verdund cellen op SD-Tryptofaan-Leucine en SD-Tryptofaan-Leucine-Adenine-Histidine media met en zonder 3-AT op een afstand van concentraties. 3-AT werkt als een competitieve remmer van de HIS3 reporter-gen, en dient om verhoging van de strengheid van het selectieproces. Het kan nuttig zijn in sommige gevallen voor het remmen van de niet-specifieke groei van zwak tot matig zelfwerkend aas.
    7. Laat de plekken om te drogen en de platen incubeer bij 30 ° C gedurende 2-4 dagen.
    8. Alle transformanten moet groeien op de SD-Tryptofaan-Leucine platen, waaruit blijkt dat zij met succes zijn getransformeerd met plasmide prooi. Aas die niet zelf te activeren zal groeien op SD-Tryptofaan-Leucine-Adenine-Histidine media alleen wanneer getransformeerd met N ub ik ten prooi constructen, en niet met N ub G prooien. Let op welke concentratie van 3-AT is vereist in de media (eventuele) omdat dit zal moeten worden gebruikt tijdens de screening.

4. Doorlichting

  1. Vereiste Media en oplossingen
    1. Steriele DDH 2 O bereid in de autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten.
    2. 0,9% NaCl-oplossing bereid in DDH 2 O en gesteriliseerd in de autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten.
    3. Natriumfosfaat oplossing bestaande uit 493 mM dibasisch en 250 mM monobasisch in DDH 2 O. Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten.
    4. X-Gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) oplossing bereid als een 100 mg / ml bouillon oplossing in N, N-dimethyl formamide.
    5. 2xYPAD Groei Media met 2% w / v gistextract, 4% w / v pepton, 4% w / v glucose en 100 uM adenine, opgesteld in DDH 2 O. Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten.
    6. Synthetische Dropout (SD) Groei Media, bereid zoals eerder beschreven. Bereid vloeistof SD-Leucine en solide SD-Tryptofaan-Leucine. Giet de vaste media in beide 100x15 mm petrischalen. Bereid solide SD-Tryptofaan-Leucine-Adenine-Histidine media in 150 mm ronde platen, 16 platen voor elk scherm, met 3-AT, indien nodig, aan de concentratie bepaald door de N ub G / I controle test.
    7. Synthetische Dropout (SD) Media + 5-Bromo-4-chloor-3-Indoyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal). Bereid SD-Tryptofaan-Leucine-Adenine-Histidine media met agar zoals eerder beschreven. Na de autoclaaf, laat afkoelen en voeg 3-AT (indien nodig), gevolgd door 1/10e volume of steriele Sodium Phosphate Solution. Voeg vervolgens X-Gal oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 80 ug / ml. Meng goed en giet het in 150 mm ronde platen.
    8. PEG / Lithium Acetaat Solution II met 40% PEG-3350, 100 mM Lithium acetaat, 1 mM EDTA en 10 mM Tris pH 7,5. Bereid deze oplossing met behulp van steriele DDH 2 O en oplossingen (bijv. geautoclaveerd 50% PEG-3350, 1 M Lithium Acetaat, 100 mM Tris pH 7,5 en 500 mM EDTA pH 8,0).
    9. Lithium Acetaat / Tris EDTA-oplossing die 110 mM Lithium Acetaat, 11 mM Tris pH 7,5 en 1,1 mM EDTA. Bereid deze oplossing met behulp van steriele DDH 2 O en oplossingen (bijv. geautoclaveerd 1M Lithium Acetaat, 100 mM Tris pH 7,5 en 500 mM EDTA pH 8,0).
    10. 10x Tris EDTA-oplossing die bestaat uit 100 mM Tris pH 7,5 en 10 mM EDTA bereid in DDH 2 O. Steriliseren in autoclaaf bij 121 ° C, 15 psi gedurende 30 minuten.
    11. Enkelstrengs DNA Carrier (ssDNA) Oplossing bevattende 2 mg / ml zalmsperma DNA-Type III natriumzout, bereid in steriele DDH 2 O.
    12. Commerciële Miniprep kit.
    13. Natronkalk glazen kralen (0,5 mm).
    14. Bevoegde Escherichia coli-cellen die geschikt zijn voor plasmide vermeerdering (bijvoorbeeld DH5a, XL10 goud) en standaard media die geschikt zijn voor bacteriële vermeerdering en plasmide selectie.
    15. Specifieke gist stammen en plasmiden, zoals beschreven in het protocol
  2. Large Scale Transformatie
    1. Inoculeren een enkele kolonie van de mythe reporter stam met daarin uw aas in 5 ml van de SD-Leucine media en incubeer overnacht bij 30 ° C onder schudden (200 rpm).
    2. Verdun de nacht cultuur in 200 ml SD-Leucine media om een ​​OD600 = 0,15 en incubeer bij 30 ° C onder schudden (200 rpm). Groeien tot de OD600 = 0,6 tot 0,7 (ongeveer 4-5 uur).
    3. Kort voor het doel OD600 is bereikt, dooi een portie van ssDNA oplossing. Koken bij 100 ° C gedurende 5 minuten en dan afkoelen op ijs. Herhaal een keer.
    4. Als het doel OD600 is bereikt, de oogst van de cellen via centrifugeren bij 700xg gedurende 5 minuten (verdeel de 200 ml cultuur tussen 4x50 mL schroefdop centrifugebuizen).
    5. Was elke pellet met 30 ml steriele DDH 2 O en in het kort vortex het monster. Centrifugeer bij 700xg gedurende 5 minuten.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in 1 ml Lithium Acetaat / Tris EDTA-oplossing. Transfer naar een steriele 1,5 ml microfugebuisje en centrifugeer bij 700xg gedurende 5 minuten.
    7. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in 600 ui van de Lithium-acetaat / Tris EDTA-oplossing.
    8. Voeg de volgende aan 4x15 mL schroefdop centrifuge buizen:
      1. 2,5 ml PEG / Lithium Acetaat Solution II
      2. 600 pi geresuspendeerd cellen
      3. 100 ul ssDNA oplossing
      4. 7 microgram van de prooi bibliotheek DNA
    9. Bibliotheken met prooien getagd op een van beide de N-of C-terminus met N ub G, en bereid uit een verscheidenheid van cDNA of genomische bronnen, zijn commercieel verkrijgbaar ( www.dualsystems.com ). De gebruikte specifieke bibliotheek moet worden bepaald op een geval per geval, afhankelijk van de geselecteerde aas en experimentele doelstellingen.
    10. Vortex de buizen gedurende 1 minuut om grondig mengen waarborgen en vervolgens incuberen in een 30 ° C waterbad gedurende 45 minuten. Meng kort om de 15 minuten.
    11. Voeg 160 ul dimethylsulfoxide (DMSO) aan elke buis en meng direct door het omkeren van de buizen.
    12. Incubeer in een 42 ° C waterbad gedurende 20 minuten.
    13. Verzamel transformanten door centrifugeren bij 700xg gedurende 5 minuten.
    14. Giet het supernatans af. Recover transformanten door resuspensie van elke pellet in 3 ml 2xYPAD. Pool alle monsters samen in een enkele 50 ml schroefdop centrifugebuis.
    15. Incubeer bij 30 ° C gedurende 90 minuten voor cel herstel.
    16. Centrifugeer bij 700xg gedurende 5 minuten en gooi het supernatant.
    17. Resuspendeer de cel pellets in 4,9 ml steriele 0,9% NaCl.
    18. Met behulp van 100 ui van de geresuspendeerde cellen voor te bereiden 10-voudige seriële verdunningen in een steriele 0,9% NaCl, variërend van 10x tot 1000x.
    19. Plaat 100 ul van de 100x en 1000x verdunningen op SD-Tryptofaan-Leucine media en incubeer bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. Deze platen dienen als een controle-en worden gebruikt om de efficiëntie van de transformatie te berekenen.
    20. Verdeel de resterende 4,8 ml geresuspendeerde cellen en de plaat op grote (150 mm) SD-Tryptofaan-Leucine-Adenine-Histidine platen,met de nodige hoeveelheid van 3-AT zoals bepaald in de N ub G / I-test, en incubeer bij 30 ° C gedurende 3-4 dagen.
    21. Resuspendeer enkele kolonies (die elk cellen met een potentiële interactie aas-prooi pair) in 100 pi van 0,9% NaCl en plaat 5 microliter aliquots op SD-Tryptofaan-Leucine-Adenine-Histidine + X-Gal media (en met 3-AT indien vereist). Laat groeien voor 2-4 dagen. Deze stap dient als een tweede ronde van selectieve screening, en helpt bij het verwijderen van valse positieven verkregen in de eerste ronde. Alleen kolonies die een sterke groei en een blauw display worden geselecteerd voor verdere analyse.
  3. Prey DNA Isolatie en Sequencing
    1. Isoleer plasmide DNA van de blauwe gist kolonies met behulp van een Miniprep protocol met de wijzigingen eerder beschreven. Zorg ervoor om op te groeien de cellen in SD-Tryptofaan media alleen, te selecteren voor het behoud van prooidieren, maar niet aas, plasmiden. Voor schermen met een zeer groot aantal hits te produceren, kan een commercieel verkrijgbare high-throughput Miniprep kit voordelig zijn op dit punt.
    2. Transformeren geïsoleerde gist plasmide DNA in een competente E. coli stam die geschikt zijn voor plasmide vermeerdering (bijvoorbeeld DH5a, XL10 Gold) met een transformatie-efficiëntie van ten minste 1x10 7 cellen / ug DNA. Merk op dat prooi plasmiden kunnen worden geselecteerd voor het gebruik van ampicilline.
    3. Plasmide DNA te isoleren uit de getransformeerde E. coli met behulp van een standaard-DNA-isolatie methode of commerciële kit. Nogmaals, kan een high-throughput Miniprep kit nuttig zijn als het monster nummer is groot. De amplificatie van het DNA in E. coli verhoogt plasmide rendement en zorgt ervoor dat een voldoende hoeveelheid DNA aanwezig is zowel voor sequencing en verdere analyse.
    4. Volgorde de geïsoleerde plasmiden met behulp van een primer complementair aan volgorde binnen de N ub G.
    5. Verzamelen en analyseren van alle sequencing gegevens naar uw eerste lijst van interactoren monteren. Dit kan handmatig worden gedaan, of op een geautomatiseerde manier met behulp van geschikte software.
  4. Aas Afhankelijkheid Testen
    1. Na montage van de voorlopige lijst van interactoren is het belangrijk om nogmaals te controleren van de interacties en promiscue prooien die interactie / activeren van de reporter-systeem op een manier die onafhankelijk is van aas identiteit te elimineren. Dit wordt bereikt met behulp van de Bait Dependency Test. In deze test worden alle van de geïdentificeerde interactoren weer omgezet in de oorspronkelijke aas stam, evenals een stam drager zijn van een controle kunstaas bestaande uit een enkel transmembraandomein gefuseerd met de C UB-LexA-VP16 tag. Transformatie is uitgevoerd volgens de standaard protocol eerder beschreven, met behulp van SD-Leucine media in plaats van YPAD en SD-Tryptofaan-Leucine vaste media voor de laatste stap plating.
    2. Resuspendeer enkele kolonies van de bovenstaande transformaties in 100 ui van steriele DDH 2 O en spot 5 microliter volumes op SD-Tryptofaan-Leucine-Adenine-Histidine + X-Gal media (en met 3-AT indien nodig). De platen worden vervolgens geïncubeerd gedurende 2-4 dagen bij 30 ° C. Idealiter meerdere transformanten worden geselecteerd voor elke prooi, en zowel de originele aas en kunstaas moet worden gespot op dezelfde plaat.
    3. Gist het dragen van de kunstaas en prooi die ervoor zorgen dat de activering van de reporter-systeem (dwz de groei en de blauwe kleur) worden beschouwd als promiscue en dat specifieke prooi wordt verwijderd uit de lijst van interactoren.
    4. Prooien die de groei en blauwe kleuring in gist veroorzaken met het aas-of-interest, maar niet het kunstaas, bevestigt deze specifieke interactie. Indien echter, gist herbergen de prooi en je aas-of-interest niet groeien, is dit prooi verwijderd uit de lijst van interactoren.
    5. De resterende prooien vormen de volledige lijst van interactoren die in de mythe scherm.

5. Verdere studies

Zodra MYTHE screening is voltooid, moet verdere analyses worden uitgevoerd om te valideren en te bepalen van de biologische betekenis van de gevonden interacties. De specifieke studies uit te voeren zal variëren van geval per geval, en moet worden bepaald door de individuele onderzoeker. Enkele veel voorkomende voorbeelden van follow-up onder andere co-immunoprecipitatie experimenten en verwijdering studies in het oorspronkelijke organisme. Bovendien kan computationele analyse van de verkregen gegevens bruikbaar voor het opsporen van patronen, en helpen om de mogelijke relevantie en de rol van verschillende interacties kunnen spelen identificeren. Zo is de MYTHE technologie dient als een krachtige eerste stap 'naar de identificatie en begrip van de kritische functionele interacties van membraaneiwitten. In combinatie met gedetailleerde follow-up studies en andere recent ontwikkelde en opkomende technologies, het belooft een waardevol instrument in het ontsluiten van de mysteries van de cel.

Figuur 1
Figuur 1. Principe van de split ubiquitine. A. Ubiquitine kunnen worden verdeeld in twee groepen: de C-terminale helft (C ub) en de N-terminale helft (N ub I). Deze groepen spontaan herstellen vanwege hun hoge affiniteit voor een ander. b. EEN ub Ik puntmutatie op positie 13 van een isoleucine naar glycine (N ub G) voorkomt deze spontane re-vereniging. c. In de mythe-systeem, is de C ub gefuseerd met het aas-of-interest (B) en de prooi is gefuseerd met het N ub G (A). AB eiwit interactie reconstitutes pseudo-ubiquitine.

Figuur 2
Figuur 2. Split-ubiquitine membraanfilters op gist twee-hybride (mythe) systeem.
Het membraan eiwit-of-interest (aas) is gefuseerd met de C-terminale helft van de gist ubiquitine (Ub C), geconjugeerd aan een transcriptiefactor. Met behulp van een cDNA of gDNA bibliotheek, wordt elk eiwit gecodeerd door de bibliotheek (prooi) gefuseerd met de overeenkomstige N-terminus van de ubiquitine-groep (N Ub G). Als de twee eiwitten interactie niet, de transcriptiefactor blijft het membraan interface (linker paneel). Echter, als de eiwitten interageren, de twee ubiquitine groepen mee, wat resulteert in splitsing door ubiquitine specifieke proteasen. Splitsing releases van de transcriptiefactor, wat resulteert in de expressie van reportergenen (rechter paneel)

Figuur 3
Figuur 3. MYTHE pijplijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MYTHE is de eerste hoge doorvoer systeem dat de identificatie van interacties tussen full-length membraaneiwitten en cytosolische of membraan-gebonden partners mogelijk maakt. Het is gebruikt om membraan eiwit studeren uit een reeks van organismen [3-7]. Er zijn echter specifieke details die mogelijk moeten worden onderzocht om ervoor te zorgen het eiwit-of-interest vatbaar is om te studeren met een mythe.

Veel membraan-gebonden eiwitten worden gericht aan het plasmamembraan via een signaalsequentie die vervolgens wordt gesplitst om het rijpe eiwit te produceren. Deze volgorde is organisme-specifieke en het is mogelijk dat dit natieve signaalsequentie zal mis-lokalisatie van het eiwit-of-interest veroorzaken wanneer uitgedrukt in gist, omdat de signaalsequentie niet wordt opgenomen. Om dit probleem te omzeilen, we ontworpen deze specifieke eiwitten worden gefuseerd aan de gist signaalsequentie, afgeleid van de mating factor alpha (MATα). Deze peptide sequentie (de zogenaamde MFα-ss) re-lokaliseert het eiwit aan de gist plasmamembraan en belangrijker, wordt gesplitst door gist signaal peptidasen. Dit peptide sequentie wordt gevonden in plasmiden pTMBV-MFα en pAMBV-MFα.

Een andere belangrijke parameter die moet worden benadrukt is aas expressie niveaus. De promotor die de expressie van het aas schijven regelt deze parameter. Het kan nodig zijn om aas expressie met behulp van de NubG / NubI-test en de hoeveelheid te optimaliseren 3-AT nodig om overexpressie artefacten, waar het aas is "self-activeren" (dwz promiscue interactie met veel niet-specifieke prooi eiwitten) te elimineren . Het onderzoeken van gist eiwitten produceert de meest fysiologisch relevante concentraties aas als iMYTH wordt toegepast. In dit geval wordt het gen-of-interest gelabeld met het Cub-TF binnen de gDNA. Als alternatief kunnen exogene eiwitten worden uitgedrukt door pBT3-STE en pCMBV plasmiden dat de CYC1 promotor resulteert in een lage aas uitdrukking te dragen. De plasmiden pTMBV en pTLB1 de haven van de TEF1 promotor, terwijl pAMBV de ADH1 promotor, zowel die drive krachtige uitdrukking van het aas eiwit. Als aas eiwit niveaus vereisen verder te optimaliseren, kan het nodig zijn om de pTLB-een plasmide dat de TEF1 promotor draagt ​​te gebruiken, echter, is het LexA DNA-bindende domein gemuteerd op R156G om de affiniteit afnemen naar de exogene reporter-gen promoters, uiteindelijk het verminderen van de kans op zelf-activatie [5].

Een andere factor die een belangrijke rol speelt voor de MYTHE succes is de bibliotheek bij uitstek gebruikt voor de screening. Dit zal afhangen van de endogene aas expressie profielen. Kan bijvoorbeeld het aas worden uitgedrukt in specifieke weefsels, en daarom is het belangrijk het gebruik van een bibliotheek die is opgebouwd uit deze specifieke weefsel. Dit zal ervoor zorgen fysiologisch relevante interacties zijn waargenomen.

Het MYTHE systeem is een eenvoudige en snelle tool die een overvloed aan informatie over een klasse van eiwitten die zijn moeilijk te bestuderen biedt. Deze geïdentificeerde interacties kunnen helpen bij het ophelderen van de volledige biologische functie van membraaneiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Igor Stagljar is een mede-oprichter van DualSystems Biotech, Zwitserland.

Acknowledgments

We willen graag Dawn Edmonds bedanken voor een kritische lezing van dit manuscript. De Stagljar lab wordt ondersteund door middelen van de Canadese Stichting voor Innovatie (CFI), het Canadese Instituut voor Gezondheid Onderzoek (CIHR), het Hart en Stroke Foundation, de Canadese Cancer Society, en Novartis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethenlene Glycol (PEG3350) BioShop Canada PEG335
Lithium Acetate Bihydrate BioShop Canada LIA001
X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-galactopyranoside) BioShop Canada XGA001
N`,N-dimethyl formamide BioShop Canada DMF 451
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) BioShop Canada ATT124
Sodium phosphate dibasic BioShop Canada SPD307
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500
Salmon Sperm DNA VWR international CA80601-120
D-Glucose BioShop Canada GLU501
LB Broth LENOX BioShop Canada LBL405
Yeast Nitrogen Base BioShop Canada YNB406
Yeast Extract BioShop Canada YEX401
Peptone BD Biosciences 211677
Bio-Tryptone BioShop Canada TRP402
Adenine Sulphate BioShop Canada ADS201
L-Uracil BioShop Canada URA241
L-Threonine BioShop Canada THR002
L-Histidine BioShop Canada HIS200
L-Methionine BioShop Canada MET222
L-Valine BioShop Canada VAL201
L-Phenylalanine BioShop Canada PHA302
L-Isoleucine BioShop Canada ISO910
L-Tyrosine BioShop Canada TYR333
L-Leucine BioShop Canada LEU222
L-Arginine BioShop Canada ARG006
L-Tryptophane Fisher Scientific BP395-100
L-Lysine BioShop Canada LYS101
L-Alanine Fisher Scientific BP369-100
Agar BioShop Canada AGR001
Soda Lime Galss Beads Biospec Products 11079105
Sodium Chloride BioShop Canada SLD002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stagljar, I., Fields, S. Analysis of membrane protein interactions using yeast-based technologies. Trends Biochem Sci. 27, (11), 559-563 (2002).
  2. Iyer, K. Utilizing the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system to identify protein-protein interactions of integral membrane proteins. Sci STKE. 275, pl3-pl3 (2005).
  3. Paumi, C. M. Mapping protein-protein interactions for the yeast ABC transporter Ycf1p by integrated split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid analysis. Mol Cell. 26, (1), 15-25 (2007).
  4. Stagljar, I. A genetic system based on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane proteins in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (9), 5187-5192 (1998).
  5. Gisler, S. M. Monitoring protein-protein interactions between the mammalian integral membrane transporters and PDZ-interacting partners using a modified split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Mol Cell Proteomics. 7, (7), 1362-1377 (2008).
  6. Scheper, W. Coordination of N-glycosylation and protein translocation across the endoplasmic reticulum membrane by Sss1 protein. J Biol Chem. 278, (39), 37998-38003 (2003).
  7. Thaminy, S. Identification of novel ErbB3-interacting factors using the split-ubiquitin membrane yeast two-hybrid system. Genome Res. 13, (7), 1744-1753 (2003).
  8. Johnsson, N., Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (22), 10340-10344 (1994).
  9. Kelleher, D. J., Gilmore, R. The Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase is a protein complex composed of Wbp1p, Swp1p, and four additional polypeptides. J Biol Chem. 269, (17), 12908-12917 (1994).
  10. Chevallier, M. R. Cloning and transcriptional control of a eucaryotic permease gene. Mol Cell Biol. 2, (8), 977-984 (1982).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics