Extrahera DNA från tarmen Mikroberna i Termite (Zootermopsis Angusticollis) och visualisering Gut Mikroberna

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna video visar en teknik för att extrahera DNA från de arter av mikrober bosatt i termit hindgut. Beredningen av en våt montera bild, vilket är användbart för att visualisera samhället tarmen mikrobiella illustreras också, och en tur genom artrika gut miljö ges.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matson, E., Ottesen, E., Leadbetter, J. Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes. J. Vis. Exp. (4), e195, doi:10.3791/195 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Termiter är bland de få djur som är kända för att ha kapacitet att överleva enbart genom att konsumera trä. Den termit tarmen tarmkanalen innehåller en tät och artrik mikrobiell population som hjälper nedbrytningen av lignocellulosa främst i acetat, den viktigaste näringsämne bränslepåfyllning termit metabolism (Odelson & Breznak, 1983). Inom dessa mikrobiella populationer är bakterier, metanbildande arkéer och i vissa ("lägre") termiter, eukaryota protozoer. Således termiter är utmärkta försökspersoner för att studera samspelet mellan mikroorganismer och de många biokemiska funktioner de utför till förmån för sin värd. Artsammansättningen av mikrobiella populationer i termit tarmar samt viktiga gener som är involverade i olika biokemiska processer har undersökts med hjälp av molekylära tekniker (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi & Leadbetter, 2003). Dessa tekniker är beroende av utvinning och rening av hög kvalitet nukleinsyror från termiter tarmen miljö. Utvinning teknik som beskrivs i den här videon är en modifierad sammanställning av protokoll som utvecklats för extraktion och rening av nukleinsyror från miljöprover (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) och det ger DNA från termiter hindgut material som lämpar sig för användning som mall för polymeraskedjereaktion (PCR).

Protocol

Sammanfattas förfarandet för termit hel-gut DNA-extraktion:

  1. Chill termiter på is, ta bort tarmen med hjälp av steril pincett och stabilisera tarmen prover i buffert.
  2. Homogenisera proverna i PVPP / SDS / fenol buffert.
  3. Utdrag och rena DNA från råolja lysat använda Qiagen DNeasy kolumner.

Protokoll:

  1. På is, ta bort inälvor från termiter arbetstagaren kast med steril pincett.
  2. Omgående överlåta tarmar och innehåll till en steril, nukleasfritt rör som innehåller 50 mikroliter iskall 1x molekylärbiologi kvalitet TE buffert (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Frys proverna vid -20 ° C, eller gå vidare direkt med homogenisering.
  3. Överför tarmen proverna och buffert till en steril, nukleasfritt 2 ml skruv maximerad rör förinstallerad med 500 mg sterilt zirkonium / kiseldioxid kulor (0,1 mm) och 700 l 1X TE buffert innehållande 1% w / v polyvinylpolypyrrolidon (PVPP ).
  4. Tillsätt 50 l på 20% natriumdodecylsulfat (SDS) och 500 l fenol i proverna.
  5. Homogenisera (pärla slå) på den högsta inställningen med hjälp av tre cykler av 30 sek homogenisering och 30 sek av kylning på is.
  6. Sediment olösligt material i 1 min vid 8000 x g..
  7. Rena 300-l alikvoter i vattenfasen (översta) lager med Qiagen DNeasy kolumner enligt metoden för råolja lysat rening.
  8. Kvantifiera nukleinsyra innehåll och prover fryser vid -20 ° C för senare användning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enligt vår erfarenhet är DNA ur mikrobiella samhällen i trä-utfodring termit arter som Zootermopis nevadensis tillräckligt rent för PCR-mall efter en runda av extraktion och rening. Dock kan vissa termiter som skräp-matning och jord-matning arter har en högre koncentration av humus i tarmen innehåll och kan kräva ytterligare rening av tarmen mikrobiella DNA. Den totala DNA avkastningen från inälvor av 5 Z. nevadensis arbetstagare är i intervallet 10-30 mikrogram. För termit arter betydligt mindre eller större än denna art, kan fler eller färre exemplar behövas för att få ett liknande belopp av DNA.

Denna metod kan lätt anpassas så att RNA-extraktion. För RNA-extraktion, ersättare 1x RNAprotect Bakterier reagens från Qiagen (catlog nr. 76.506) för det iskalla TE buffert som beskrivs i steg 2 i protokollet. Qiagen RNeasy reagenser och kolumner (catlog nr. 74.104) bör användas i stället för den DNeasy rening som beskrivs ovan. Som DNA kan renas från RNAprotect stabiliserad prov och endast 300 mikroliter av ca. 700 mikroliter vattenskiktet hämtas i steg 7 krävs för nukleinsyra rening, kan denna metod användas för att hämta både DNA och RNA parallellt från ett enda prov.

Dessa tekniker är beroende av utvinning och rening av hög kvalitet nukleinsyror från termiter tarmen miljö. Utvinning teknik som beskrivs i den här videon är en modifierad sammanställning av protokoll som utvecklats för extraktion och rening av nukleinsyror från miljöprover (fler et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi & Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) och det ger DNA från termiter hindgut material som lämpar sig för användning som mall för polymeraskedjereaktion (PCR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PVPP/SDS/phenol Buffer homogeneization buffer
DNeasy Tissue Kit Kit Qiagen 77607 Used according to the protocol for isolation of genomic DNA from crude lysates (Appendix H, product manual version: July 2003)
TE Buffer Sigma-Aldrich T9285 1x buffer (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) from 100x concentrate
zirconia/silica beads Supplies Biospec Products 11079101z 0.1 mm
PVPP Reagent Sigma-Aldrich P6755 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone prepared from dry reagent as a 1x suspension in TE buffer
Zootermopsis nevadensis Animal Termites
SDS Reagent Sigma-Aldrich L4390 Sodium dodecyl sulfate 20% soln. in water from dry reagent
Phenol Reagent Sigma-Aldrich 77607 TE-saturated, ~73%
MiniBeadbeater-8 Tool Biospec Products 963
BSS Buffered Salt Solution, pH 7.2 Formulation per liter: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, and 10 mL of a 1M soln. of NaHCO3
AxioPlan-2 Microscope Carl Zeiss, Inc. Outfitted with 40x objective, 1.6x optivar and 10x ocular lenses. Samples were viewed using phase contrast illumination

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
  2. Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
  3. Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
  4. Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
  5. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
  6. Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
  7. Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
  8. Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
  9. Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).

Comments

10 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. I would also like to know the magnification used to view the microbes and if any phase contrast was used with the microscope setup. Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 20, 2007 - 6:24 PM
  3. As indicated in the updated protocol, a Zeiss AxioPlan-² Imaging microscope was used to aquire the images of termite gut microorganisms using Phase contrast illumination. Our particular set up allows magnification of samples up to 1,600X. This is accomplished using a 100X oil immersion objective lens + a 1.6X optivar + a 10X ocular lens. However, the images in the video use a 40X hi-dry phase contrast objective lens + the 1.6X optivar. To make the video, the videographer replaced the eyepiece with an adapter and attached the camera to that. Because we did not use a scale bar in these videos I do not know the magnification at which the camera recorded so the final magnification will depend on that factor + the window size used to view the video. I will say that the resolution is approximately consistent with what I observe at 640X magnification.

    Reply
    Posted by: Eric M.
    January 14, 2008 - 1:37 AM
  4. hello sir sir i am a project fellow in IIIM in india i want to know manual method how to isolate total DNA from termite and beetle gut(wood borer).sir kindly if you can provide me protocol for this i will be very thankful to you as i am in very need of it. thanking you sir and waiting for your reply

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 17, 2008 - 8:18 AM
  5. Hello,sir.I am interest in the manual DNA extraction methods from organic tissue,and acquire the best concentraction of DNA, can you provide me for this protocol, thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2009 - 6:21 AM
  6. The information should appear below the video on the JOVE website, and a PDF of the protocol should be downloadable, however, I notice that the link dŒs not currently work. An alternative path to the document can be found by searching the article on PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) and choosing the full-text article from PubMed central. I've contacted JOVE to restore the file on their website. Several strategies for purifying insect gut-community DNA exist. A crucial step in any extraction procedure is to remove PCR-inhibiting substances if present. We have found that 1% w/v polyvinylpolypyrrolidone works well on DNA derived from termite gut contents.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2009 - 3:14 AM
  7. good job! very cool!

    Reply
    Posted by: jacqui s.
    December 12, 2009 - 7:28 AM
  8. Hi! I'm korean student. I want to see this full video.then what can i do?

    Reply
    Posted by: Hyun Y.
    October 31, 2014 - 9:47 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics