Парафин и замороженные Разделы Drosophila Мышцы взрослых

Biology
 

Summary

Определение механизмов, лежащих повреждение мышц имеет решающее значение. Здесь мы представляем гистологической техники для подготовки парафин и замороженных участков Drosophila грудной мышцы. Это позволяет анализировать морфологию мышц и локализация белка и других компонентов клетки мышц.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Yatsenko, A. S., Klepzig, A., Shcherbata, H. R. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. J. Vis. Exp. (46), e2438, doi:10.3791/2438 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Молекулярная характеристика мышечной дистрофии и миопатии у людей выявил сложность заболевания мышц и генетический анализ мышечной спецификации, формирование и функции в модельных системах предоставил ценную информацию в мышечную физиологию. Таким образом, выявление и характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе повреждения мышц имеет решающее значение. Структура взрослых дрозофил мульти-волокна мышц напоминают позвоночных поперечно-полосатых мышц 1 и генетических уступчивость дрозофилы сделала большой системы для анализа морфологии дистрофические мышц и охарактеризовать процессы, затрагивающие мышечной функции в процессе старения взрослых мух 2. Здесь мы представляем гистологической техники для подготовки парафин и замороженных участков Drosophila грудной мышцы. Эти препараты позволяют ткани, которая будет окрашивали классических гистологических пятен и помечены с белком обнаружения красителей, и, в частности cryosections идеально подходят для иммуногистохимического выявления белка в интактных мышцах. Это позволяет для анализа структуры мышечной ткани, определение морфологических дефектов, и обнаружение экспрессии для мышечной / нейрон-специфических белков в мышцах дрозофилы взрослых. Эти методы также могут быть слегка модифицирован для секционирования других частей тела.

Protocol

1. Подготовка

  1. Недавно подготовить фиксатором Карнуа путем объединения абсолютного этанола, хлороформа и ледяной уксусной кислоты в соотношении 6:03:01 соответственно. 3 Это, а также все решения для погружения воротники следует хранить в стеклянных банках окрашивания (см. раздел реагентов для рекомендации).
  2. Подготовка алюминиевой фольги карманы правильный размер для воротников.
  3. Подготовьте следующие решения в окрашивании банки: 2 х 40% этанол, 70% этанола, 2 х 100% этанол, метилбензоата (МБ), 50/50 об. / МБ и парафина, 2 х парафин. Место МБ и парафина контейнеров в термостат до 60-65 ° С.
  4. Теплый парафин вылить в фольгу карманы до 60-65 ° С.

2. Крепление Летает в воротничков

  1. Прикрепите воротник 4 под бинокулярным с помощью липкой ленты в вертикальном положении, где можно увидеть точки входа для летать.
  2. Обезболить мухи использованием углекислого газа или с помощью гипотермии использованием ледяная глыба. Будьте осторожны, чтобы не заморозить мух.
  3. Использование щипцов, подобрать индивидуальный мухи, захватывая их крыльев и поместить в воротник ориентированных правильно (головы и грудной клетки в верхней части лезвия и живота ниже лезвия). 10-20 мухи должны легко вписываться в воротник.

Примечание: Если вы анализируете несколько генотипов, не забудьте сделать сведению воротник номер и соответствующий генотип.

3. Парафин Разделы дрозофилы Thoraxes

  1. Перемещение воротник к решению Карнуа и зафиксировать ткань при температуре 4 ° С в течение ночи.
  2. После фиксации обезвоживают образца с помощью увеличения концентрации этанола. За 10 минут погрузиться воротник на 40% (2 раза), 70% и 100% (2 раза) этанола при комнатной температуре. Следующая воротник инкубировать в МБ и МБ + парафин решение (1:1) в течение 30 минут в каждой, а затем проникнуть воротник в две смены парафина в течение 60 минут каждый на 60-65 ° C. Быстро переместить воротник в фольгу карман и заполнить с топленым (60-65 ° С) парафин. Поместите его при комнатной температуре и позволяют парафином, чтобы стать жесткой (лучше всего оставить на ночь). Обратите внимание, что воротник можно поместить в карман в фольгу различной ориентации, в зависимости от ориентации разделы вам нужно (продольные или поперечные).
  3. Берем сухой блоков парафина с воротниками из фольги и аккуратно отделить воротником из парафинового блока. С помощью острого лезвия или скальпеля аккуратно вырезать экстра-парафин со всего летать ткани.
  4. Вырезать парафиновый блок с 7-10 мкм разделе шаги на вращение микротома и позволяют сократить ткани плавать квартиру в 37 ° С водяной бане. Место секционного ткани на полярных слайды и дать высохнуть в течение ночи. Эти слайды можно использовать для окрашивания hematoxyline и эозином (рис. 1А-D), толуидиновым синим, анилин синий или другой умирает для визуализации тканевых структур, а также для окрашивания антител (рис. 1E-E ``).

4. Cryosections дрозофилы Thoraxes

  1. Как и парафиновых срезов, подготовке летит в ворота и моды кармана алюминиевую фольгу. Замораживания кулер будет, необходимых для подготовки образцов. Убедитесь, что кулер составляет около -60 ° C, используйте немного этанола и сухой лед, чтобы для достижения этой температуры. Час, прежде чем начать эксперимент положил бутылку крио-вложение среды (ткани-Tek октября соединения) вниз головой в 4 ° C холодильник, чтобы охладить его и свести к минимуму образование воздушных пузырьков.
  2. Перемещение воротник с летит в фольге карман, который был предварительно охладить в течение нескольких минут внутри замерзания охладителя и быстро заполнять крио-вложение соединения. Пусть образец заморозить в течение 3-10 мин. Аккуратно развернуть формируется блок внутри кулера, мягко отдельный воротник из вложения блок и поместить его при температуре -20 ° С в течение не менее одного дня.
  3. Вырезать замороженных мышц на крио-микротома от -15 до -18 ° C с раздела толщиной 10-15 мкм. Место на поляризованных слайдов и сохранить при температуре -20 ° С до готовности делать дальнейшую обработку. Мы предлагаем крепления ткани в 4%-ный раствор формальдегида PBS в течение 10 мин при комнатной температуре до антитела окрашивания.

5. Липиды обнаружения в мышцах дрозофилы

Липидные капли могут быть обнаружены с маслом красной O пятно на cryosections использованием протокола, принятого от Зибер и Thummel 5.

  1. После фиксации, мыть слайды с водой два раза в течение 5 мин, уравновешенную пропиленгликоля в течение 10 мин и инкубировать в течение 3 ч в масле красного пятна O при комнатной температуре. Затем промыть образцы 2 раза по 5 мин в пропиленгликоля и 30 мин в PBS. Горы в 30% глицерина.

6. Представитель Результаты:

Рисунок 1
Инжиррисунке 1. Парафиновыми-срезы
Hematoxyline и эозином окрашенных поперечных (АВ) и продольного (CD) разделы косвенные мышцы полета. А и С показывает нормальную структурированную мышц. Аномальные по размеру и морфологии мышц представлены на B и D соответственно (черные стрелки). Поперечный разрез окрашенных грудной клетки дрозофилы с анти-LAMC, ядерной маркер конверт и DAPI, ядерной пятна (EF). Увеличенное изображение нормального (красная стрелка) и ухудшилось (желтая стрелка), мышц (F). G представляет раздел дрозофилы кишечного тракта с окрашенных LAMC и DAPI.

Рисунок 2
Рисунок 2. Замороженные срезы
А. Поперечные закрепленные участки дрозофилы грудной клетки окрашиваются красным маслом O, этикетка липидные капли.
Б. Продольное замороженных срезах косвенных летательные мышцы окрашиваются анти-Dg, мышечные сарколеммой маркер и DAPI.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

Мы благодарим профессора Eichele за предоставленную нам возможность использовать крио-микротоме. Работа была профинансирована Max-Planck-Gesselschaft.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel collars Home made Specially constructed
Forceps Fine Science Tools 11295-10
Aluminum foil Any Supplier
Blade or scalpel Any Supplier
Wheaton macro staining jar Wheaton 900200
Microtome Carl Zeiss, Inc. Model: Hyrax M25
Cryo-microtome Leica Microsystems Model CM3050S
60-65°C Incubator Any Supplier Large enough to hold at least 4 staining jars
Freezing cooler with metal block Any Supplier Store at -80°C
Super-frost slides Thermo Fisher Scientific, Inc. 9161155
Cover slips Any Supplier Recommend 24 X 40 mm
Chloroform Sigma-Aldrich 288306 Analytical grade
Glacial acetic acid Merck & Co., Inc. 100063 Analytical grade
Ethanol Merck & Co., Inc. 100983 Analytical grade
Methylbenzoate Sigma-Aldrich M29908-500G Analytical grade
Paraplast plus Sigma-Aldrich 76258 Paraffin
Tissue-Teck O.C.T. compound Sakura Finetek 4583
16% formaldehyde, methanol free Polysciences, Inc. 18814
Glycerol Sigma-Aldrich G5150-1L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).
  2. Shcherbata, H. R. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy. The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).
  3. Kucherenko, M. M. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex. PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).
  4. Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. Carnoy fixation: practical and theoretical considerations. Histochemie. 16, 361-36 (1968).
  5. Ashburner, M. Drosophila - A Laboratory Manual. CSHL Press. (1989).
  6. Sieber, M. H., Thummel, C. S. The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila. Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).

Comments

1 Comment

  1. FYI - you can buy the collars on flystuff.com Fly Collar
    This Drosophila collar is precision machined of 100% high-grade stainless steel to assure durability and ease of use. The gap width comes pre-set and is adjustable with a standard screwdriver. Based on the original designs of Dr. Heisenberg.
    Cat# Description List Price Your Price
    48-100 Fly Collar 90.00 Click Here

    Reply
    Posted by: Matthew L.
    May 15, 2012 - 7:39 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics