सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक ग्रूव पैटर्न के साथ microfluidic युक्ति

Biology

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Summary

हम microfluidic उपकरणों है कि सेल को पकड़ने और संस्कृति सक्षम कर सकते हैं के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस दृष्टिकोण में microfluidic चैनल के अंदर grooves के रूप में नमूनों microstructures कम कतरनी तनाव क्षेत्रों के भीतर जो सेल गोदी कर सकते हैं बनाने के लिए उपयोग किया जाता है.

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Chung, B. G., Manbachi, A., Khademhosseini, A. A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior. J. Vis. Exp. (7), e270, doi:10.3791/270 (2007).

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Abstract

हम सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए microgrooved पैटर्न के साथ एक microfluidic युक्ति का वर्णन करता है. यह microfluidic मंच एक शीर्ष fluidic चैनल और एक नीचे microgrooved सब्सट्रेट के होते हैं. Microgrooved चैनल बनाना, एक शीर्ष पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) microfluidic चैनलों की छाप युक्त मोल्ड गठबंधन किया गया था और एक microgrooved सब्सट्रेट करने के लिए बंधुआ है. इस डिवाइस का प्रयोग, माउस fibroblast कोशिकाओं immobilized और microgrooved substrates के भीतर नमूनों (25, 50, 75, और 100 सुक्ष्ममापी चौड़ा). एक microfluidic डिवाइस में apoptosis का अध्ययन है, हाइड्रोजन पेरोक्साइड, Annexin वी और propidium आयोडाइड युक्त मीडिया 2 घंटे के लिए fluidic चैनल में perfused था. हमने पाया है कि oxidative तनाव को उजागर कोशिकाओं apoptotic बन गया. इन apoptotic कोशिकाओं Annexin वी द्वारा पुष्टि की गई है कि apoptosis प्रक्रिया के दौरान प्लाज्मा झिल्ली की बाहरी पत्रक पर phosphatidylserine करने के लिए बाध्य है. Microgrooved पैटर्न के साथ इस microfluidic युक्ति का प्रयोग, apoptosis प्रक्रिया वास्तविक समय में मनाया गया और एक ऊष्मायन कक्ष (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) से युक्त एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विश्लेषण. इसलिए, इस microfluidic डिवाइस microgrooved substrates के साथ शामिल सेलुलर व्यवहार का अध्ययन है और उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग प्रदर्शन के लिए उपयोगी हो सकता है.

Protocol

Microfluidic डिवाइस के ए Microfabrication

  1. 4 इंच सी वफ़र प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्लाज्मा (30W, Harrick वैज्ञानिक में 5 मिनट, एनवाई) के साथ इलाज किया जाता है.
  2. नकारात्मक photoresist (SU-8 2015, Microchem, एमए) एक सी वफ़र पर 1 मिनट के लिए 900 rpm पर स्पिन लिपटे है.
  3. वफ़र नरम 95 पर बेक्ड डिग्री सेल्सियस एक hotplate पर 6 मिनट के लिए और एक मुखौटा microchannels युक्त फिल्म के माध्यम से 4 मिनट के लिए यूवी प्रकाश (200W) को उजागर.
  4. वफ़र 95 में सुखा हुआ पोस्ट डिग्री सेल्सियस 6 मिनट के लिए है और SU-8 photoresist डेवलपर का उपयोग कर विकसित.
  5. photoresist नमूनों microchannels युक्त वफ़र एक पेट्री डिश में रखा गया है.
  6. (Dimethylsiloxane) पाली (PDMS) (184 Sylgard) molds मिश्रण सिलिकॉन elastomer और इलाज एजेंट (10:01 अनुपात) के द्वारा गढ़े हैं.
  7. PDMS मिश्रण सी मास्टर मोल्ड पर डाल दिया है और बुलबुले को दूर करने के लिए एक निर्वात desiccator पर रखा है.
  8. PDMS 70 डिग्री सेल्सियस पर 1 ~ 2 घंटे के लिए ठीक है.
  9. PDMS नए नए साँचे तो सी मास्टर मोल्ड से से खुली हैं.

बी डिवाइस कोडांतरण

  1. 40 सुक्ष्ममापी मोटी शीर्ष fluidic चैनलों और 40 मोटी नीचे microgrooved चैनल (25, 50, 75, और 100 μ मीटर चौड़ा) सुक्ष्ममापी दो अलग सी मास्टर molds से प्राप्त कर रहे हैं.
  2. चैनल और fluidic डिवाइस के इनलेट आउटलेट छिद्रित हैं.
  3. Fluidic चैनलों और microgroove चैनलों अचल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्लाज्मा (30W, Harrick वैज्ञानिक में 5 मिनट, एनवाई) द्वारा बंधुआ रहे हैं.
  4. कोशिकी मैट्रिक्स (ईसीएम) (यानी fibronectin) microfluidic युक्ति के अंदर इनक्यूबेटर में 1 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए लेपित है.

सी. सेल बोने और प्रयोगात्मक सेटअप

  1. NIH-3T3 माउस fibroblasts Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM) मीडिया 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त का उपयोग कर एक टिशू कल्चर फ्लास्क में सुसंस्कृत हैं.
  2. कक्ष trypsinized और अलग हैं.
  3. Dissociated कोशिकाओं 3 के सेल घनत्व × 10 6 कोशिकाओं / एमएल (चित्रा 1) पर microgroove चैनल में लोड कर रहे हैं.

    चित्रा 1
    चित्रा 1

  4. 2 एमएल मीडिया, 100 मिमी एच 2 2 हे, और apoptosis परख (20 μL Annexin वी और 40 μL propidium आयोडाइड, Invitrogen, सीए) एक एक सिरिंज पंप (1 μl / मिनट) के प्रयोग से चैनल में संचार कर रहे हैं.
  5. कक्ष एक औंधा माइक्रोस्कोप (Nikon ते 2000) का उपयोग करके निगरानी वास्तविक समय कर रहे हैं.

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Discussion

कक्ष immobilized और एक microfluidic डिवाइस में microgrooved substrates के भीतर नमूनों. हाइड्रोजन पेरोक्साइड को उजागर कोशिकाओं की apoptosis प्रक्रिया के वास्तविक समय में मनाया गया और Annexin वी और propidium आयोडाइड का उपयोग करके विश्लेषण किया. इस प्रकार, इस microfluidic microgroove चैनल वाले डिवाइस उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है.

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS Reagent K.R. Anderson Co. 2065622 Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
DMEM medium Invitrogen 11965 Dulbecco’s Modified Eagle’s Media
FBS serum Invitrogen 10082-147 Fetal Bovine Serum
Hydrogen peroxide Reagent Sigma-Aldrich H1009
Apoptosis assay Invitrogen V13242 Annexin A, propidium iodide
Negative photoresist MicroChem Corp. SU-8 2015
Si wafer Tool 4 inch silicone wafer
Reactive oxygen plasma Reagent Harrick Scientific Products, Inc. treat wafer 5 min at 30W
inverted microscope Tool Nikon Instruments TE 2000

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References

  1. Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
  2. Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
  3. Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).

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