התקן Gradient מניבות Microfluidic עבור ביולוגיה של התא

Published 8/30/2007
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

אנו מתארים פרוטוקול עבור microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic כי ניתן להפיק הדרגתיים במרחב ובזמן ב microenvironment מוגדרים היטב. בגישה זו, המכשיר שיפוע מניבות microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד נדידת תאים מכוונת, embryogenesis, ריפוי פצעים, ועל גרורות סרטניות.

Cite this Article

Copy Citation

Chung, B. G., Manbachi, A., Saadi, W., Lin, F., Jeon, N. L., Khademhosseini, A. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271, doi:10.3791/271 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ייצור ותפעול של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic לחקר התנהגות תאית מתואר. פלטפורמה microfluidic הוא כלי ניסיוני המאפשר, כי זה יכול דווקא לתפעל זורם נוזל, לאפשר תפוקה גבוהה ניסויים, וליצור יציבות הדרגתיים ריכוז מסיסים. בהשוואה גנרטורים שיפוע קונבנציונלי, פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) מכשירים microfluidic מבוסס יכול ליצור מעברים הדרגתיים ריכוז יציב של גורמי גדילה עם פרופילים מוגדרים היטב. הנה, פיתחנו פשוט שיפוע מניבות מכשירים microfluidic עם שלושה פתחי הכניסה נפרדת. שלושה microchannels לשלב אחד microchannel ליצור מעברים הדרגתיים ריכוז. היציבות ואת הצורה של הדרגתיים גורם גדילה אושרו על ידי והעמסת isothyiocyanate (FITC)-dextran עם משקל מולקולרי דומה גורם הגדילה באפידרמיס (EGF). שימוש המכשיר microfluidic, הראינו כי fibroblasts חשופים הדרגתיים ריכוז של EGF נדדו לעבר ריכוזים גבוהים יותר. התמצאות כיוונית של נדידת תאים ו תנועתיות של תאים נודדים הוערכו כמותית על ידי ניתוח התא מעקב. לפיכך, התקן זה שיפוע מניבות microfluidic עשוי להיות שימושי עבור לימוד וניתוח התנהגותם של תאים נודדים.

Protocol

א Microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic

  1. רקיק סי מטופל עם פלזמה החמצן מגיב (5 דקות ב 30W, Harrick מדעי, ניו יורק).
  2. Photoresist שלילית (SU-8 50, Microchem, MA) היא ספין מצופה בסל"ד 1000 דקות 1 על פרוסות סיליקון Si.
  3. רקיק הוא רך אפוי על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על פלטה חמה.
  4. רקיק הוא נחשף לאור UV (200W) עבור 3 דקות דרך מסכה שקיפות עם גודל התכונה מינימלי של 30 מיקרומטר.
  5. רקיק הוא שלאחר אפוי על 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ו - 95 ב מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  6. סי עובש הורים עם 100 ערוצי מיקרומטר עבה הוא פותח באמצעות SU-8 מפתח photoresist.
  7. רקיק המכיל microchannels מושם בצלחת פטרי,.
  8. תבניות פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) מיוצרים על ידי אלסטומר סיליקון ערבוב סוכן ריפוי (יחס 10:01).
  9. התערובת PDMS הוא שפך על עובש האב סי.
  10. עובש האב סי מושם על ייבוש ואקום כדי להסיר בועות במשך 10 דקות.
  11. PDMS נירפאים ב 70 ° C עבור 1 ~ 2 שעות.
  12. תבניות PDMS הן קילף מהתבנית האב סי.

ב ניסויית ההתקנה

  1. כניסת Cell, מוצא, וכן יציקת פתחי הכניסה של המכשיר PDMS מבוסס microfluidic הם חבט באמצעות הבוקרים חדה.
  2. מכשיר ו שקופיות הזכוכית (2 × 3 ס"מ) מודבקים באופן בלתי הפיך על ידי הפלזמה החמצן מגיב (5 דקות ב 30W, Harrick מדעי, ניו יורק).
  3. צינורות פוליאתילן (PE 20, בקטון Dickinon, MD) הוא מוכנס לתוך פתחי הכניסה יציקת של המכשיר microfluidic ומחוברים לאחר מכן משאבת מזרק.
  4. Isothiocyanate והעמסת (FITC)-dextran (MW = 10kD, 10 מיקרומטר, Sigma) ו חיץ (PBS, Invitrogen, CA) הם החדיר לתוך המכשיר microfluidic לאשר הדרגתיים יציבה בתוך המכשיר fluidic.
  5. תאי מטריקס (ECM) (כלומר, פיברונקטין) מצופה בתוך המכשיר microfluidic שעה 1 ב בחממה (37 ° C).
  6. תאים פיברובלסטים NIH 3T3 הם trypsinized ו ניתק.
  7. תאים ניתק נטענים לתוך המכשיר microfluidic (800 מיקרומטר רחב) בשעה צפיפות התא של 2 × 10 6 תאים / מ"ל.
  8. 2 מדיה מ"ל ו 50 ng / ml גורם צמיחה אפידרמיס (EGF), הוא החדיר לתוך מכשיר microfluidic להפקת הדרגתיים מסיסים באמצעות משאבת מזרק (0.05 μl / min).
  9. תאים הם בזמן אמת לנטר כל 5 דקות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (ניקון TE 2000).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תאים שנחשפו הדרגתיים ריכוז יציב של EGF במכשיר microfluidic נדדו לעבר ריכוזים גבוהים יותר. התמצאות כיוונית של נדידת תאים, מדד chemotactic, תנועתיות של תאים נודדים נחקרו על ידי ניתוח התא מעקב. לכן, זו פלטפורמה שיפוע מניבות microfluidic יכול להיות שימושי עבור לימוד גרורות סרטן, embryogenesis, והכוונה האקסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Dextran-FITC Reagent Sigma-Aldrich FD10S Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD)
hr-EGF Invitrogen 13247-051 human recombinant Epidermal growth factor
PDMS K.R. Anderson Co. 2065622 Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
Negative photoresist MicroChem Corp. SU-8 50
Si wafer silicone wafer, 4 inch
Petri dishes
Polyethylene tubing BD Biosciences PE 20
PBS Invitrogen
Fibronectin
NIH 3T3 cell-line fibroblast cells
Inverted microscope Nikon Instruments TE 2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
  2. Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
  3. Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
  4. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
  5. Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).

Comments

1 Comment

  1. I wanna try it on my cells. Can you give me some ready-to-use devices?

    Reply
    Posted by: Grace C.
    April 21, 2009 - 9:24 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats