बाहरी बारी बिजली फील्ड उत्तेजना और उच्च गति छवि विश्लेषण के एक युग्म के साथ बाहरी बाल सेल गतिशीलता की जांच

Neuroscience

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Summary

बाहरी बाल सेल (OHC) चलता - फिरता प्रतिक्रियाओं, सहित electromotility, धीमी गति गतिशीलता और झुकने, की जांच के लिए एक विश्वसनीय विधि वर्णित है. OHC गतिशीलता उत्तेजना के द्वारा एक बाहरी बारी बिजली के क्षेत्र के साथ हासिल है, और विधि उच्च गति छवि रिकॉर्डिंग, रोशनी एलईडी आधारित, और पिछली पीढ़ी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का लाभ लेता है.

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Kitani, R., Kalinec, F. Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis. J. Vis. Exp. (53), e2965, doi:10.3791/2965 (2011).

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Abstract

Protocol

1. OHCs के अलगाव

  1. गिनी सूअरों, चूहों या अपने स्तनधारी पशु मॉडल से अस्थायी हड्डियों की कटाई के द्वारा इस प्रक्रिया शुरू करो.
  2. अगला, लौकिक एक कान में की हड्डी चिमटा का उपयोग क्रम में कोक्लीअ बेनकाब हड्डियों को खोलने के लिए, और उन्हें लेबोविट्ज़ एल 15 में विसर्जित. हड्डी अधिक ध्यान से निकालें, बोनी खोल बरकरार रखते हुए. जबकि यह किसी भी स्तनधारी प्रजातियों के अस्थायी हड्डियों के लिए लागू सामान्य प्रक्रिया है, तकनीक के लिए मामूली परिवर्तन आवश्यक हो सकता है जब बहुत छोटे जानवरों से अस्थायी हड्डियों से निपटने कर सकते हैं. पुराने पशुओं में आम तौर पर, bulla calcified प्रक्रिया के लिए एक अतिरिक्त जटिलता शुरू.
  3. अति सूक्ष्म अवलोकन के तहत, कोक्लीअ के शिखर क्षेत्र को खोलने और हलकी लीक vascularis और सर्पिल बंधन # 11 स्केलपेल ब्लेड के टिप का उपयोग कर निकालने, एक सूक्ष्म बिंदु लेने और ठीक एक चिमटी से नोचना.
  4. Corti के अंग कर्णावत modiolus का उपयोग चिमटी से नोचना से उतारो, और यह 1mg/ml collagenase में L-15 में कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए डाल दिया.
  5. यदि कोक्लीअ के बेसल मुड़ता से OHCs की जरूरत है, बोनी खोल लेने के साथ कोक्लीअ के आधार कवर हटाने, और लौकिक Corti के अंग निकालने से पहले स्केलपेल ब्लेड का उपयोग हड्डी से सर्पिल अलग.
  6. रिकॉर्डिंग एक 50 μL हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर कक्ष Corti के अंग स्थानांतरण. उसके बाद, सुई के माध्यम से भाटा द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना.

2. प्रायोगिक सेटअप

  1. बाहरी बारी बिजली फील्ड (EAEF) जनरेटर और छवि पर कब्जा प्रणाली (1 छवि) के साथ उनके लिंक के आरेख. नियंत्रण circuitry विशेष रूप से सदन कान संस्थान के इंजीनियरिंग कोर में लागू किया गया था.
  2. हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक सेटअप एक Axiovert एक वैकल्पिक रोशनी एलईडी आधारित प्रणाली के साथ 135TV उलटा माइक्रोस्कोप (Zeiss, Thornwood, एनवाई) के होते हैं (हाई पावर एलईडी प्रणाली 36AD3500, Lightspeed टेक्नोलॉजीज, कैम्पबेल, सीए), दो इलेक्ट्रॉनिक micromanipulators (Eppendorf "Patchman", जर्मनी), एक पीसी नियंत्रित अति उच्च गति Photron Fastcam X केलर बंदरगाह में 1024 पीसीआईघड़ी (Photron संयुक्त राज्य अमेरिका, Inc) कैमरा और एक अतिरिक्त trinocular बंदरगाह में नियमित रूप से सीसीडी कैमरा. Fastcam कैमरा उच्च आवृत्तियों (100.000 एफपीएस) और उच्च संकल्प (उदाहरण के लिए, 1000 fps पर 1024 x 1024 पिक्सल, 512 10,000 fps, 18,000 fps पर 96 x 384 128 x, और इतने पर) पर छवियों पर कब्जा करने में सक्षम है. उच्च गति कैमरा द्वारा प्रदान की छवियों को सीधे पीसी की निगरानी में मनाया जाता है, जबकि एक अलग मॉनिटर करने के लिए सीसीडी कैमरा जुड़ा हुआ है. अनुरूप कम शक्ति और उच्च शक्ति डिजिटल: रोशनी एलईडी आधारित प्रणाली दो अलग अलग मोड में काम करता है. सभी प्रारंभिक (इलेक्ट्रोड पोजीशनिंग, सेल स्थिति, ध्यान, आदि) प्रक्रियाओं कम शक्ति के अनुरूप मोड का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर रहे हैं. उच्च - शक्ति रोशनी पर कैमरा शटर के एपर्चर द्वारा बंद है और फिर शटर बंद करके बंद, गर्मी लंपटता की सुविधा. घर सॉफ्टवेयर, भी सदन कान संस्थान इंजीनियरिंग कोर में विकसित, एक ही पीसी पर चल रहे उच्च गति कैमरा, रोशनी एलईडी आधारित प्रणाली है, और EAEF के ट्रिगर को नियंत्रित करता है. एक पारंपरिक सामने बंदरगाह में डिजिटल फोटो कैमरा जरूरत के रूप में अभी भी फ्रेम के लिए अनुमति देता है. (छवि 2 एक).
  3. इलेक्ट्रोड (दो .25 मिमी व्यास में 0.8 मिमी की टिप दूरी के साथ एजी तार) इलेक्ट्रॉनिक micromanipulators के उपयोग की स्थिति के लिए प्रेरित कर रहे हैं. 'इलेक्ट्रोड स्थिति नेत्रहीन और सूक्ष्म छवि के माध्यम से निगरानी की है, छवि के फोकल हवाई जहाज़ में एक परिवर्तन को इंगित करता है कि इलेक्ट्रोड प्रयोगात्मक चैम्बर के नीचे छुआ. प्रारंभ में, बिजली के क्षेत्र में एक बाहरी इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए calibrated है. इस इलेक्ट्रोड के विभिन्न बिंदुओं पर बिजली के संभावित उपायों, बिजली के क्षेत्र के एक "नक्शा" उत्पन्न. यदि एक एकल पृथक बाहरी बाल सेल इलेक्ट्रोड के सुझावों के बीच अपनी अनुदैर्ध्य अक्ष लागू EAEF करने के लिए समानांतर के साथ रखा गया है, यह elongating और बिजली के क्षेत्र का एक ही आवृत्ति पर छोटा कदम होगा. यदि सेल क्षेत्र के लिए सीधा रखा जाता है OHC प्रतिक्रिया (झुकने) के एक अलग प्रकार और देखा जा सकता है की जांच की. (छवि 2 बी)

3. EAEF उत्तेजना और छवि पर कब्जा

  1. चार अलग अलग उत्तेजना प्रोटोकॉल चयन कर रहे हैं (3 छवि):
    1. सतत एकल आवृत्ति (छवि 3 ए). ध्यान दें कि उत्तेजना मोड, आवृत्ति, आयाम और लहर प्रकार घर का बना नियंत्रण सॉफ्टवेयर (लाल हलकों) का उपयोग कर चुना जा सकता है.
    2. bursted एकल आवृत्ति (छवि 3 बी). फट फटने और अंतराल के बीच की लंबाई भी चयन कर रहे हैं.
    3. रैखिक झाडू (छवि 3 सी). प्रारंभिक और अंतिम आवृत्तियों का चयन कर रहे हैं.
    4. बहु उत्तेजना (छवि 3 डी). एकल आवृत्ति और रैखिक sweeps एक ही प्रयोग में जोड़ा जा सकता है है. तदनुरूप पैरामीटर का चयन करने के बाद, नियंत्रण सॉफ्टवेयर सिस्टम कॉन्फ़िगर और ऑपरेटर में एक बटन क्लिक करके प्रकाश सिंक्रनाइज़ वीडियो रिकॉर्डिंग और सेल उत्तेजना आरंभ करने के लिए अनुमति देता हैकंप्यूटर स्क्रीन.
  2. छवियाँ उच्च आवृत्तियों पर आगे के विश्लेषण के लिए AVI प्रारूप में कब्जा कर रहे हैं.

4. प्रतिनिधि परिणाम

  1. इस फिल्म में, दो पृथक बाहरी बालों की कोशिकाओं लंबाई या वक्रता में परिवर्तन जब वे एक बाहरी बारी बिजली के क्षेत्र में है कि समानांतर या आड़ा है, क्रमशः के साथ किया जा रहा है प्रेरित कर रहे हैं दिखाने अपनी अनुदैर्ध्य अक्ष के लिए. (# 2 मूवी).
  2. OHCs चलता - फिरता प्रतिक्रियाओं से लाइन ProAnalyst सॉफ्टवेयर (Xcitex इंक, कैम्ब्रिज, एमए) का उपयोग करते हुए विश्लेषण कर रहे हैं. इस सॉफ्टवेयर में "फ़ीचर ट्रैकिंग समारोह" फ्रेम फ्रेम (4 छवि) के दो अंक के बीच की दूरी प्रदान करता है. और सेल (बेसल पोल, हरे रंग) के आधार; सुप्रीम (लाल रंग Cuticular प्लेट) में चयनित अंक के बीच की दूरी छोटा सेल के दौरान छोटी है, और सेल बढ़ाव के साथ बढ़ जाती है. फिल्म फ्रेम फ्रेम लंबाई में परिवर्तन का विश्लेषण सॉफ्टवेयर से पता चलता है. छवि के नीचे पैनल आंदोलन के निशान से पता चलता है. इस उदाहरण में, कुल लंबाई में परिवर्तन 6.5 पिक्सल के बारे में है.
  3. "समोच्च ट्रैकिंग" ProAnalyst सॉफ्टवेयर में समारोह सेल बढ़त का पता लगाने और स्वचालित रूप से ऑप्टिकल अनुभाग के क्षेत्र (छवि 5) उपाय कर सकते हैं.
  4. Polystyrene microspheres स्नान बेतरतीब ढंग से समाधान करने के लिए जोड़ा और मजबूती प्लाज्मा झिल्ली (6 छवि एक) को देते हैं. विभिन्न microspheres एक साथ चयनित किया जा सकता है, और सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से उनमें से फ्रेम से फ्रेम के सभी ट्रैक कर सकते हैं. इस तरह, कोशिकाओं को वर्गों में विभाजित किया जा सकता है और प्रत्येक अनुभाग के गतिशीलता स्वतंत्र मूल्यांकन. (छवि 6 एक)
  5. Microspheres सेल छवि के पार्श्व किनारों पर स्थित का चयन करके, प्रत्येक खंड की लंबाई में परिवर्तन और एक खंड के लिए सम्मान के कोण में परिवर्तन अन्य (झुका) भी स्वतंत्र मूल्यांकन किया जा सकता है. (छवि 6B)

चित्रा 1
चित्रा 1 EAEF जनरेटर और छवि पर कब्जा प्रणाली के साथ अपने संबंध के आरेख .

चित्रा 2
चित्रा 2. प्रयोगात्मक सेटअप के एक) चित्र. बी) खुर्दबीन मंच के इलेक्ट्रोड और एक एकल अपनी अनुदैर्ध्य अक्ष बिजली के क्षेत्र में समानांतर के साथ उन दोनों के बीच रखा OHC चित्रण कार्टून के साथ, विस्तार.

चित्रा 3
चित्रा 3.) घर का नियंत्रण एकल आवृत्ति उत्तेजना के लिए कॉन्फ़िगर सॉफ्टवेयर के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस. चयनित पैरामीटर के रूप में लाल रंग में परिक्रमा कर रहे हैं. बी) घर का बना नियंत्रण सॉफ्टवेयर के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस फट आवृत्ति एकल उत्तेजना के लिए कॉन्फ़िगर. सी) घर का बना नियंत्रण रैखिक झाडू उत्तेजना के लिए कॉन्फ़िगर सॉफ्टवेयर के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस. डी) घर का नियंत्रण बहु उत्तेजना के लिए कॉन्फ़िगर सॉफ्टवेयर के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस.

चित्रा 4
चित्रा 4 दो आधार () हरे और सेल, क्रमशः, ProAnalyst सॉफ्टवेयर के "फीचर ट्रैकिंग" समारोह का उपयोग करने के शीर्ष (लाल) में चयनित अंकों के साथ एक OHC के एकल फ्रेम. सेल नीचे वक्र चयनित बिजली की उत्तेजना के साथ जुड़े बिंदुओं के बीच दूरी में आवधिक परिवर्तन दिखाता है. ऊर्ध्वाधर बार अलग फ्रेम चलती व्यक्तिगत विश्लेषण के लिए चयनित किया जा सकता है है.

चित्रा 5
चित्रा 5 ProAnalyst में कंटूर ट्रैकिंग "समारोह सेल बढ़त का पता लगाता है और स्वचालित रूप से ऑप्टिकल अनुभाग के क्षेत्र को मापने.

चित्रा 6
चित्रा 6 एक अलग OHC) पर कब्जा कर लिया छवि polystyrene microspheres (ऊपर), और पाँच के साथ एक ही छवि microspheres व्यक्तिगत चयनित (नीचे) के साथ सजाया . एक अलग रंग प्रत्येक microsphere सौंपा गया था, और उनके displacements व्यक्तिगत रूप से और स्वचालित रूप से फ्रेम फ्रेम द्वारा ट्रैक किए गए हो सकते हैं, विश्लेषण और तुलना में. बी) मनमाना लंबाई के अनुभाग polystyrene चयन सेल के किनारों पर स्थित microspheres द्वारा परिभाषित किया जा सकता है, और इन क्षेत्रों की लंबाई में परिवर्तन के साथ ही एक खंड सम्मान के अभिविन्यास में दूसरों के लिए परिवर्तन (सेल झुकने) स्वचालित रूप से किया जा सकता है फ्रेम का मूल्यांकन छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ फ्रेम.

मूवी एक गिनी पिग OHCs के अलगाव. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के

मूवी 2. OHCs समानांतर और सीधा EAEF ठेठ electromotility और झुकने प्रतिक्रियाओं दिखा. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के

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Discussion

प्रायोगिक विधि यहाँ प्रस्तुत सेल आंदोलन के लिए किसी भी प्रतिबंध के बिना kHz के रेंज में OHC चलता - फिरता प्रतिक्रियाओं का आकलन सक्षम बनाता है. विभिन्न उत्तेजना प्रोटोकॉल, अतिरिक्त मार्कर (microspheres), बिजली क्षेत्र के लिए सम्मान के साथ अच्छी तरह से सेल के उन्मुखीकरण में परिवर्तन के रूप में, यह पहले दुर्गम विस्तार का एक स्तर के साथ संभव OHC गतिशीलता के नए पहलुओं की जांच करने के लिए. अन्य विधियों, जैसे उन 9 photodiodes या लेजर डॉपलर vibrometry 10 का उपयोग, सेल की स्थिति के एक तंग नियंत्रण की आवश्यकता होती है. यहाँ, इसके विपरीत में, सभी मापन बिंदुओं के बीच एक ही कक्ष से संबंधित प्रदर्शन कर रहे हैं, और हर विस्थापन केवल सेल आकार में और संदर्भ के एक बाहरी फ्रेम करने के लिए सम्मान के साथ उनके आंदोलन के साथ नहीं परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है. पार के अनुभागीय OHC क्षेत्र के विश्वसनीय माप भी आसानी से प्राप्त कर रहे हैं, जो OHC मात्रा में तेजी से परिवर्तन के एक अनुमान के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, तेजी से और अधिक संवेदनशील कैमरों और बेहतर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के सतत विकास, विधि की गुणवत्ता में निरंतर सुधार की गारंटी. तकनीक, प्लाज्मा झिल्ली भर में बिजली क्षमता पर कोई नियंत्रण नहीं है, के एक नकारात्मक पक्ष यह सभी मौजूदा kHz के रेंज में OHC गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के साथ साझा सीमा है.

इस प्रकार, विधि यहाँ वर्णित अनुसंधान सुनवाई के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है, सेलुलर और आणविक 'OHCs चलता - फिरता प्रतिक्रियाओं अंतर्निहित तंत्र के बारे में नए और महत्वपूर्ण सुराग प्रदान करने में सक्षम हो सकता है

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

कार्य स्वास्थ्य अनुदान R01DC10146/R01DC010397 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित है, p30 DC006276 रिसर्च कोर NIDCD, और HEI. इसकी सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और NIH या HEI के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं. लेखक ब्याज की कोई मौजूदा या संभावित संघर्ष की घोषणा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 GIBCO, by Life Technologies 21083
Collagenase (Type 4) Sigma-Aldrich C5138 1mg/mL in L-15

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References

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