Боковые ударные жидкости: Модель черепно-мозговой травмой у мышей

Neuroscience
 

Summary

Боковой удар жидкости (LFP), создана модель черепно-мозговой травмы у мышей, демонстрируется. LFP выполняет три основных критерия для животных моделях: достоверность, надежность и клиническое значение. Процедура, состоящая из хирургической трепанации черепа, фиксации центра следуют индукции травмы, в результате очаговых и диффузных повреждений, описывается.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063, doi:10.3791/3063 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Удаление фрагментов костей черепа

  1. Стерильные хирургические сайт подготовлен в том числе стереотаксической инструмент выравнивания (Kopf Instruments) для мышек с анестезией мыши газ головой держатель (Kopf Instruments) связаны с анестезией машина с O 2 флеш (Паркленд Scientific), чтобы обеспечить непрерывное вдыхание изофлуран во время операции . Потепление площадку хранится при температуре 37 ° C находится под указателем мыши во время операции. Операционный микроскоп и источник света не требуется. Экспериментатор должен носить халат, хирургическую маску, ноги покрытие, перчатки и головной убор. Все инструменты и материалы, которые контактируют с места операции должны быть стерилизованы.
  2. Травмы концентратор, состоящий из женщин конце Луер-лок, создан отрезав металлический конце 20 г 1 ½ "иглы (Becton Dickinson) с лезвием бритвы. Хаб должны быть сокращены с небольшой уклон и имеют приблизительно 3 мм внутренний диаметр отверстия. трепан (см. шаг 1,10) может быть использован для измерения и изготовить травмы центром правильного диаметра. Один концентратор требуется на одно животное. хаб будет прикреплен к черепу и подключен к LFP Устройство для доставки импульс давления.
  3. Твердые шнур нейлона (1,7 мм в диаметре, например сорняков линии триммер) разрезается на ~ 1 мм диск с помощью лезвия бритвы. Опять же, один диск требуется на одно животное. Это используется для стабилизации трепан при выполнении удаление фрагментов костей черепа (см. шаг 1,10).
  4. Мыши могут быть любого штамма и возраста (у нас в основном используют C57BL / 6 в возрасте от 1 - 9 месяцев). Мышь взвешивается и анестезии в небольшую камеру индукции (предварительно заполнены 4-5% изофлуран в 100% O 2) в течение не менее 1 минуты. Для упреждающей анальгезии, инъекции buprenorphrine (0,1 мг / кг) дается внутрибрюшинно и мыши помещается обратно в камеру еще на минуту. Болеутоляющие режима должна быть подтверждена путем проведения консультаций с местными использование животных и ухода комитета.
  5. Волосы на верхней части головы мыши отделана как можно ближе к коже, насколько возможно. Мышь позиционируется в стереотаксической инструмент выравнивания оснащены укуса покрытием предназначены для управления летучих анестезии газа (Kopf Instruments). Уровень изофлуран газа снижается до 2%, или на эффект. Дыхание скорость контролируется визуально во время операции. Другие физиологические параметры, такие как газы крови O 2, р CO 2), рН крови и артериальное давление можно измерить с помощью соответствующего оборудования во время процедуры.
  6. Искусственные слезы смазка глазная мазь наносится на глаза мышей с помощью ватного аппликатора, чтобы держать их от высыхания. Повидон-йод наносят на кожу между глаз и шеи с помощью ватного аппликатора затем 70% спирта. Применение повидон-йод и спирт повторяется в общей сложности 3 раза.
  7. Средней линии разрез кожи головы производится от глаз до шеи с помощью скальпеля (# 15 лезвие) и кожи убирается с небольшим зажимы бульдога (Fine Инструменты наук # 18050-28) подвергать черепа и обеспечивают четкое операционного поля. Бульдог зажимы свисают боковые края черепа.
  8. Актуальные анестезии бупивакаин (0,025% в физиологическом растворе) наносится на череп с аппликатором хлопка и фасции Царапины от черепа с кончика стоматологического инструмента или кости скребком (например, тонкие инструменты, науки, # 10075-16).
  9. Перманентный маркер используется для обозначения черепа на полпути между брегмы и лямбда, а также между сагиттального шва и бокового гребня над правым полушарием (~ 2 мм право средней линии). Капли Loctite цианоакрилат клей (Loctite Tak Пак 454) ставится в пластиковый весят лодке и боковые схватив щипцами (Fine инструменты Наука, Дюмон # 6) используются для падения диска сорняков твердых шнур нейлона (см. 1.3 выше) в клей, а затем нажмите диск на след на черепе. Через одну-две капли Loctite Ускоритель поставляется на верхней части диска с помощью шприца 1 мл и 26 3 / 8 G игла вызывает упрочнение клея. Испытание приверженность диск череп прежде чем продолжить.
  10. Место 3 мм, внешний диаметр трепан (Научно-исследовательский инструментарий магазин, Университет Пенсильвании) над диском и спина по часовой стрелке, пока вы не прорезать черепа. Проверьте прогресс в трепан часто, чтобы избежать бурения слишком далеко в черепе и нарушения оболочки. Там будет истончение черепа по периметру диска и черепа лоскут будет чувствовать себя свободно при нажатии слегка. Место стоматологических инструментов параллельного / горизонтально на поверхности черепа, чтобы вырвать под черепом и поднимите костный лоскут вверх. Отсоедините кости черепа щипцами. Если есть небольшое количество кровотечения, без компромиссов твердой мозговой оболочки, использование хлопка аппликатор, чтобы оказать давление, пока кровотечение не остановится и не допустить кости попадания пыли на твердой мозговой оболочки. Тем не менее, если есть нарушения в твердой мозговой оболочки, что грыжа видна, животное должно быть исключено из эксперимента гуманной эвтаназии. Этот шаг требует достаточной практикидля достижения хирургических навыков требуется.
  11. Использование щипцов, поддерживать травмы центра в положение над удаление фрагментов костей черепа в черепе так, что смещение центра совмещена с кривизной черепа (то есть больше краю концентратора лежит вблизи боковых гребня черепа). Между тем, используя деревянную палку, разрезать под углом лезвие, чтобы иметь острый кончик, нанесите гель супер клей вокруг внешних краев концентратор с противоположной стороны и стабилизировать центром, пока она прикреплена вертикально над отверстием. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не получить клея в верхней части оболочки. Клей на длительность вызовет ослабление травмы.
  12. С помощью небольшой бумажный стаканчик, смешать метил-метакрилат стоматологических акриловых (Jet Acrylic Liquid с пермскими выровнять / Ремонт Ресин, Шейн Батлер), чтобы создать вязкий раствор. Используйте 1 мл шприц с иглой не применять цемент по всему травма хаба. Цемент должен покрыть дно 2 мм травмы центром, а также окружающие подвергаются черепа. Череп швы герметизируются с цементом, чтобы жидкости болюсно от травмы остается в полости черепа.
  13. Заполнить центр стерильным 0,9% NaCl (физиологический раствор) с помощью шприца и иглы притупляются. Солевой будет держать влажной оболочки во время фазы восстановления. Кроме того, если травма хаб не остается заполнены, что будет означать утечку в центр связи с черепом и нового центра должна быть приложена. Мышь должна быть предоставлена ​​инъекции 0,25 мл стерильного физиологического раствора IP, удаляются из стереотаксического прибора выравнивание и поместили в пустую клетку без крышки провод бар на потепление пластины. Поместите некоторые hydragel на дно клетки и позволяют мышам восстановить в течение 1-2 часов.

2. Индукция травмы

  1. Включите осциллограф (Tektronix TDS 1001B, двухканальный осциллограф Digi 40 МГц, 500Ms.s) и усилителем (травма индуктора Датчик давления усилителя), который подключен к устройству LFP. Убедитесь, что устройство LFP (Custom Дизайн и изготовление, Virginia Commonwealth University) и высокого давления, трубы (длина 41 см, объем 2 мл, Бакстер # 2C5643), подключенных к ней заполнены стерильной водой и без пузырьков воздуха. В конце трубка мужчина Луер-лок кусок. С Луер-лок конца трубки закрыты, доставить испытательных импульсов, выпустив маятника. Устройство следует загрунтовать, поставляя около 10 испытательных импульсов. Убедитесь, что маятник дает гладкий сигнал на осциллограф и усилитель. Зашумленного сигнала указывает воздуха в системе, которые должны быть удалены до предоставления травмы импульса. Длительность импульса должна быть около 20 мс. Преобразователь усилитель поставляется с устройством LFP откалиброван так, что 10 мВ = 1,0 фунтов на квадратный дюйм (PSI). Один атмосферы (ATM) = 14,7 PSI. Травма давления поставляются, как правило, в диапазоне 0,9 - 2,1 атмосфер, чтобы произвести ряд рефлекса раза и увеличение смертности, связанных с отеком легких. Мягкий травмы считается рефлекса время 2 - 4 мин и 0 - 5% смертности. Причинение средней тяжести вреда считается время рефлекса 6 - 10 мин и 10 - 20% смертности. Если необходимо, отрегулируйте угол маятника для увеличения или уменьшения интенсивности импульса. Угол исходное положение маятника составляет примерно 10 градусов. После корректировки LFP устройства, не забудьте открыть Луер-Лок конце трубки.
  2. Мышь находится в 4-5% изофлуран камеры анестезией (без предварительной зарядки) до хирургической анестезии плоскости будет достигнута. Мыши помещается на платформу рядом с LFP устройства и концентратор заполняется стерильным физиологическим раствором. Трубок LFP устройство с мужчинами Луер-лок прилагается к женскому Луер-лок установку концентратора. Животное находится на его стороне и как только возобновится нормальное дыхание картины, но до полного восстановления животного сознания (~ 2 мин), маятник устройство LFP выпущен вызывает одиночный импульс травмы. Важно, чтобы не вызывать травмы в то время как животное слишком анестезии, как это может привести к дыхательной недостаточности и смерти. Точное давление пульс должен быть записан. Пострадал, притворство животные проходят все те же процедуры, за исключением фактического импульса жидкости, чтобы вызвать травмы.
  3. Животное должно быть немедленно удалены с устройства LFP и размещен на его обратно на монитор рефлекса времени. После мышь исправила сама, она затем кратко наркозом снова и цемента и ступицы удаляется вместе с черепом вручную. Скальпа затем закрывается с Vetbond ткани клей (3М), шовный или скоб. Любая грыжа оболочки или окклюзии концентратор отмечено. Окклюзии центр будет производить ослабленный травмой неизвестной величины. Животное помещается обратно в клетку на площадку до потепления амбулаторно, а затем вернулся в родную клетку.

3. Оценка двигателя, познавательные и гистологические результаты

  1. Движениетор дефицит вызван LFP можно определить с помощью теста rotarod, показатель интегрированных vestibulomotor и сенсомоторной функции 21. Все животные должны быть проверены до травмы, чтобы определить базовые чтение и акклиматизироваться мышей парадигмы. Мыши проходят обучение на устройство rotarod 3 раза в день с 1-часовых интервалов для intertrial за два дня до травмы. Задержки балансировать на 36-мм наружный диаметр, вращающемся стержне, который имеет резиновую поверхность измеряется. Скорость увеличивается с 4 до 40 оборотов в минуту в течение интервала 180 сек. Каждое испытание заканчивается, когда животное падает rotarod.
  2. В разные моменты времени после травмы (как правило, 1, 7 и 21 дней), мышей снова протестирован на устройстве rotarod. Оценка rotarod тестов после травмы на основе индивидуальных значений по отношению к их базовой задержки 22. Среднее время ожидания до падения ранения мышей по сравнению с мышами обман.
  3. Когнитивные функции после LFP могут быть проверены на отдельный набор мышах лабиринт Морриса Вода (МВМ), с большой точностью оценивать посттравматических пространственной памяти обучения и работы на грызунах 23. Мыши приспособиться к парадигме и проверены на базовый ответ, используя видимые тестовой платформы 4 дня до травмы. Белый круговой бассейн (1 м в диаметре) заполнен водой и нетоксичных белой краской. Платформа становится видимым использовании флага или маркер и не визуальные подсказки на стенах. Более 4 испытания, мышь находится в квадранте противоположным видимых платформы, и задержки, чтобы найти платформу измеряется. Максимальное время судебного разбирательства 60 сек и мышь остается или помещают на платформу на 15 секунд в конце каждого испытания. Intertrial интервал составляет 5 минут в течение которого мыши нагревается на грелку. Платформа перемещается в другой квадрант для каждого испытания и четыре испытания выполняются.
  4. Для оценки обучения, мышей обучаются на MWM с помощью скрытой платформы фиксируется в одном из 4 квадрантов в различные моменты времени после травмы (как правило, 1, 7 и 21 дней). Черно-белый сигналы размещаются на стенах. Квадрант, в котором мышь размещенных псевдослучайно разнообразны протяжении подготовки и времени, чтобы найти платформу записывается. Максимальное время судебного разбирательства 60 сек и мышь остается или помещают на платформу в течение 15 сек и нагревают в течение 5 минут между испытаниями. Мыши подвергались 8 исследований / день в течение 3 дней подряд. Для оценки сохранение данных в памяти, животные подвергаются суду 60 зонд с дня, следующего за последние тренировки. Во время зонд суда, платформы удаляется, чтобы определить потраченное время и расстояние плавал в квадранте, где платформа раньше. Наконец, видимые тестовой платформы будет сделано, чтобы исключить возможные двигательного и зрительного дефицита, который разработан после травмы.
  5. Для определения гистологического последствия LFP травмы, ткани фиксируется intracardial перфузии в 0,9% NaCl, затем 4% параформальдегида в нужное время очков после травмы. Ткань постфиксами течение ночи при 4 ° С и затем cryoprotected в 10% и 30% сахарозы и внедрения решения. Замороженные серийных срезов разрезаются на криостате и обработаны с использованием различных immuohistochemical и гистологических методов.

4. Представитель Результаты:

Травмы индуцированной устройство LFP воспроизводится от животного к животному, в частности, с достаточной хирургической подготовки. Чтобы сохранить целостность травмы, количество давления доставлены оболочки на устройство находится под контролем. Маятник ударов заполненные водой акриловую цилиндр высокого давления, насосно-компрессорные и Луер-лок установки, которая связана с травмой центром прикреплены к удаление фрагментов костей черепа сайта на животных (рис. 1А). Для легкой и средней тяжести, угол маятника устанавливается для создания давления в пределах от 0,9 - 2,1 атм и осциллограф подключен к усилителю используется для визуализации импульс давления (рис. 1В). Травма производит целый ряд рефлекса раза и увеличение смертности, связанных с отеком легких. Мягкий травмы считается рефлекса время 2 - 4 мин и 0 - 5% смертности. Причинение средней тяжести вреда считается время рефлекса 6 - 10 мин и 10 - 20% смертности. Кроме того, мышей, подвергнутых воздействию LFP могут проявлять тоник позерство, что может свидетельствовать о конфискации. Захват часто ассоциируется с угрозой оболочки. Вместе взятые, эти результаты показывают, что травма вызывает неврологические повреждения. Шам животных связаны с устройством LFP но маятник не выпустили.

Для визуализации повреждений, вызванных LFP, мы выполнили иммуноцитохимии с использованием антител, которые распознают астроциты и макрофагов оба из которых являются типы клеток связано с ответом на травму. Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) окрашивание показывает увеличился глиоз всей коры в районе травмы WHereas фиктивный мышей не отображаются увеличился astrocytosis в эквиваленте сайт ниже удаление фрагментов костей черепа (рис. 2а, б). Точно так же MAC1 окрашивание демонстрирует более макрофаги окружающих месте повреждения по сравнению с мышей, подвергавшихся операции обман. Кроме того, часто физические повреждения корковой ткани видны в мышей, подвергнутых воздействию LFP, но не в мнимой мышей (рис. 2в, г).

Поведенческие тестирование следующей мягкий LFP могут быть использованы для оценки как когнитивные и моторные результатов. МВМ используется для определения последствий для обучения и памяти. Использование визуальных подсказок в тестировании комнате, притворство мышей быстро стало более эффективным при поиске платформы с каждым последующим днем ​​обучения в водном лабиринте. Мыши подвергались мягкий LFP занять больше времени, чтобы найти скрытые платформы на первых двух дней тестирования по отношению к мнимой мышей, но затем появляются, чтобы узнать задание на третий день (рис. 3А). Эти результаты показывают, что травма снижает скорость, с которой мышь может приобрести пространственного обучения. Чтобы определить, последствия травм на сохранение данных в памяти, датчик суда осуществляется через 1 день после последней тренировочной сессии. Шам мышей проводить больше времени в целевой сектор по сравнению с мышей, подвергнутых воздействию мягкого LFP предположить, что травма повлияла на способность мышей вспомнить место, где платформа, используемая для проживания (рис. 3В). Для оценки двигательной функции, мыши были протестированы на устройство rotarod. Мыши подвергались мягкий LFP имеют более короткие среднее время ожидания падать по сравнению с мнимой мышей на 1, 7 и 21 день после травмы (точек на дюйм) (рис. 3С). Эти данные свидетельствуют о том, что ранения мышах нарушением интегрированной vestibulomotor и сенсомоторной функции.

Рисунок 1
Рисунок 1. LFP устройства и представитель след от осциллографа, полученные в ходе травмы. ) Компоненты устройства LFP являются: маятник крепится к подставке и под углом предопределено обеспечить желаемые силы, заполненных водой акриловую цилиндра высокого давления труб и мужчины Луер-лок установки прилагается, усилитель, и осциллограф. Б) представитель след импульса давления от осциллографа. Пик-пик значения 2,16 вольт указывает давление 1,47 атм.

Рисунок 2
Рисунок 2. Расширенные глиоз и воспалительные реакции после LFP демонстрирует высокую степень травмы. Замороженные поперечного сечения (20 мкм) через мозг мышей подвергали мнимого хирургии (А, С) или LFP травмы (B, D) 7 дней после травмы (точек на дюйм). Корковая изображения взяты в эпицентре удаление фрагментов костей черепа. (А, В) Ткань окрашивали антителами для выявления астроцитов. Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) антител (MAB360, Chemicon, 1:400) показывает большее число астроцитов всей коре мыши подвергались LFP травмы (стрелки) по сравнению с хирургии обман. Вторичные антитела антимышиного 594 (1:1000). (C. D) Ткань окрашивали антителами для выявления макрофагов. MAC1 антител (MAC1-альфа цепи CD11b, BD Biosciences, 1:50) показывает больше macrophges и / или активированных микроглии вокруг места повреждения в коре головного мозга (стрелки) по сравнению с хирургии обман. Вторичные антитела козьи антитела крысы Cy3 (1:50). Шкала бар = 200 мкм в А и В, 100 мкм в С и D.

Рисунок 3
Рисунок 3. Поведенческие тестирование следующей мягкий LFP демонстрирует дефицита ранения по сравнению с мнимой мышей. ) Мыши подвергались мягкий LFP занять больше времени, чтобы узнать задача найти платформу в MWM, чем мыши, обман. Шам против LFP (пр. секунд ± SEM) 1 день 34,21 ± 3,02 против 38,64 ± 2,63; 2 день 24,52 ± 2,84 против 27,21 ± 2,11; 3 день 22,47 ± 2,00 против 22,08 ± 2,52 (1 дюйм, п = 9 обман, 10 LFP) . Б) мышей, подвергнутых воздействию мягкого LFP тратить меньше времени в целевом квадранте во время зонд суда 24 часа после последнего обучения в MWM относительно мнимой мышей (21 точек на дюйм, п = 10). С) Мыши подвергались мягкий LFP упасть rotarod устройство раньше, чем притворство мышей (1, 7 и 21 точек на дюйм, п = 5 обман, 8 LFP). Планки погрешностей представляют SE.

Discussion

Метод LFP, представленные здесь модели многих neuropathalogical и поведения от легкой до умеренной черепно-мозговой травмой и именно поэтому он стал широко используются животной модели ЧМТ. Есть несколько важных шагов для рассмотрения в целях повышения достоверности и надежности этой техники. Например, важно, что только животные, у которых целостность оболочки не был скомпрометирован в течение удаление фрагментов костей черепа может быть подвергнут LFP и использованы в исследовании. Кроме того, если удаление фрагментов костей черепа является окклюзии любой клей или цемент, что часть оболочки под удаление фрагментов костей черепа не подвергается силу давления жидкости, животное должно быть исключено из исследования. Наконец, если рефлекса времени или смертность не в желаемом диапазоне, животное не должно быть включено в исследование. Интенсивность импульса давления может быть увеличено для получения более тяжелых травм.

Как показано на рисунке 1, конфигурация устройства LFP относительно проста и воспроизводимость Степень повреждения ведется мониторинг атмосфер давления на осциллограф. Гладкой формы кривой на осциллограмме указывает, что Есть нет воздушных пузырьков в жидкости, которые могут помешать индукции травмы LFP. Контрольный импульс должен быть доставлен до вызывающих повреждение и если осциллограмма не обладает гладкой кривой, пузырьки воздуха должны быть удалены. Длительность импульса составляет примерно 20 мс который представляет индукции время, измеряемое в симуляции краш-тестов. Травмы более коротких импульсов могут привести к несколько инстанций, травм. Таким образом, эта длительность импульса модели человеческого TBI.

Морфологические и клеточные изменения следующих LFP включают физические повреждения тканей, а также увеличение числа астроцитов и макрофагов, как показано на рисунке 2. Хорошо известно, что одним из отличительных признаков травмы гиперплазия астроцитов и образование глиальных шрам. Глиальных шрам как было показано, имеют как положительные, так и негативные последствия 24. Аналогичным образом, макрофаги, как известно, накапливаются в различных тканях при травме следующей фазе, когда процесс заживления начинается 25. Таким образом, увеличение числа GFAP и MAC1 положительных клеток в LFP образцы относительно мнимого контроля свидетельствует об индукции травмы. Отсутствие экспрессии те ячейки специфических маркеров в контрольной группе мнимой означает, что хирургические манипуляции сами по себе не иметь негативные последствия на здоровье тканей головного мозга, и что изменения в экспрессии белка являются специфическими для травму парадигмы.

Поведенческие последствия мягких LFP показано на рисунке 3 включает когнитивные и моторные дефициты. MWM данные показывают, что LFP мышей в конечном счете узнаете задача, но более медленными темпами, чем мышей притворство, и они не помню, задачи, а на следующий день после тренировки. Таким образом, даже слегка ранения мышей менее эффективны, чем притворство мышей при использовании внешних сигналов для обработки, консолидации и хранения пространственной информации, которые должны быть получены в ходе последующих испытаний. Другие гиппокампа зависит от когнитивных задач, таких как условный рефлекс страха было показано, что нарушение у мышей подвергали LFP 26. Наконец, тем короче задержка сократится на LFP мышей относительно мнимой мышей в парадигме rotarod до 3-х недель после легкой травмой является показателем дефицита в интегрированных vestibulomotor и сенсомоторной функции. Более умеренные травмы покажут более поразительные изменения в когнитивной функции и двигатель, как было показано в других группах 27-30.

В общем, LFP является допустимым модель для человеческого TBI, потому что эта система удовлетворит многих ожидаемых критериям. LFP обеспечивает построить действия тем, что он воссоздает этиологических процессов, которые вызывают ЧМТ у человека. В частности, величина силы, а уровень смертности аналогичный тому, который происходит в легкой и среднетяжелой спортивных автомобилей и травм с оговоркой, что до травмы хирургические вмешательства являются уникальными для животных моделях. LFP также экспонаты валидность в том, что LFP повторяет многие из анатомических, биохимических, нейропатологических и поведенческие эффекты, наблюдаемые в человеческой TBI. Есть и очаговых и диффузных изменений обнаружено после LFP и латерализации воздействия позволяет сравнивать морфологические повреждения на стороне ипсилатерального на повреждения, что на противоположной стороне. Одно предостережение в том, что когнитивные и моторные эффекты могут быть более тонкими, в результате ранения только одно полушарие. Наконец, LFP экспонатов прогностическая валидность и надежность техники LFP обеспечивает оценку различных фармакологических и генетических манипуляций, до или после индукции травмы 20. Физиологические переменных, таких как кровяное давление, рН крови и кровигазы должны быть измерены в присутствии и отсутствии испытуемого препарата, чтобы определить механизм действия терапевтического агента. Однако из-за сложного характера первичных и вторичных последствий ЧМТ, это трудная задача для идентификации одного вмешательства, которые могут уменьшить все симптомы.

Один рассмотрения в будущем для техники LFP может быть использование микро-жидкость ударных в котором работают с микропроцессорным управлением, пневматическим приводом инструмента для устранения необходимости для калибровки силы выступил маятника и, чтобы избежать оперативного переменных, таких как воздушные пузырьки в жидкости 15 . Тем не менее, стандартный подход LFP было доказано многими исследователями как надежный и простой метод для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе повреждения и восстановления после ЧМТ, которые приведут к лучшему вмешательства и терапии.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа финансируется Нью-Джерси, Комиссия по изучению мозга травмы.

Materials

  • Stereotaxic alignment instrument for mice (Kopf Instruments)
  • Mouse gas anesthesia head holder (Kopf Instruments)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Buprenorphrine (Webster Animal Supply)
  • Refresh Lacri Lube eye ointment (Fisher)
  • Bupivacaine/Marcaine (Webster Animal Supply)
  • Povidone-iodine solution (Fisher)
  • 20 g 1 ½” needles (Becton Dickinson)
  • Scalpel blade (#15) and holder (Becton Dickinson)
  • Bulldog clamps (Fine Science Tools)
  • Dental tool or bone scraper (Fine Science Tools)
  • Side grasping forceps Dumont #6 (Fine Science Tools)
  • 3mm outer diameter trephine (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania)
  • Solid nylon cord (1.7 mm diameter, e.g. weed trimmer line)
  • Super glue gel
  • Loctite cyanoacrylate glue (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation)
  • Jet Acrylic Liquid (Butler Schein)
  • Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein)
  • Storage Oscilloscope TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix)
  • Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • LFP device (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • High-pressure tubing, length 41cm, volume 2ml (Baxter)
  • 3M Vetbond Tissue Adhesive (Fisher)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cernak, I. Animal models of head trauma. NeuroRx. 2, 410-422 (2005).
  2. Reilly, P. L. Brain injury: the pathophysiology of the first hours.'Talk and Die revisited'. J Clin Neurosci. 8, 398-403 (2001).
  3. Hovda, D. A. The increase in local cerebral glucose utilization following fluid percussion brain injury is prevented with kynurenic acid and is associated with an increase in calcium. Acta neurochir. 51, 331-333 (1990).
  4. Whiting, M. D., Baranova, A. I., Hamm, R. J. Cognitive Impairment following Traumatic Brain Injury, Animal Models of Cognitive Impairment. CRC Press. (2006).
  5. McIntosh, T. K. Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model. Neuroscience. 28, 233-244 (1989).
  6. Adams, J. H. Diffuse axonal injury in head injury: definition, diagnosis and grading. Histopathology. 15, 49-59 (1989).
  7. Cordobes, F. Post-traumatic diffuse axonal brain injury. Analysis of 78 patients studied with computed tomography. Acta Neurochir. 81, 27-35 (1986).
  8. Maxwell, W. L., Povlishock, J. T., Graham, D. L. A mechanistic analysis of nondisruptive axonal injury: a review. J Neurotrauma. 14, 419-440 (1997).
  9. Lighthall, J. W., Anderson, T. E. The neurobiology of cenral nervous system trauma. 3-12 (1994).
  10. Marcoux, J. Persistent metabolic crisis as measured by elevated cerebral microdialysis lactate-pyruvate ratio predicts chronic frontal lobe brain atrophy after traumatic brain injury. Crit Care Med. 36, 2871-2877 (2008).
  11. McIntosh, T. K. Neuropathological sequelae of traumatic brain injury: relationship to neurochemical and biomechanical mechanisms. Lab Invest. 74, 315-342 (1996).
  12. Morganti-Kossmann, M. C., Satgunaseelan, L., Bye, N., Kossmann, T. Modulation of immune response by head injury. Injury. 38, 1392-1400 (2007).
  13. Capruso, D. X., Levin, H. S. Cognitive impairment following closed head injury. Neurol Clin. 10, 879-893 (1992).
  14. Levin, H. S., Goldstein, F. C., High, W. M., Eisenberg, H. M. Disproportionately severe memory deficit in relation to normal intellectual functioning after closed head injury. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 51, 1294-1301 (1988).
  15. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nat Protoc. 5, 1552-1563 (2010).
  16. Cherian, L., Robertson, C. S., Contant, C. F., Bryan, R. M. Lateral cortical impact injury in rats: cerebrovascular effects of varying depth of cortical deformation and impact velocity. J Neurotrauma. 11, 573-585 (1994).
  17. Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39, 253-262 (1991).
  18. Flierl, M. A. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4, 1328-1337 (2009).
  19. Lifshitz, J. Chapter 32. Animal Models of Acute Neurological Injuries. Chen, J., Xu, Z. C., Xu, X. -M., Zhang, J. H. Humana Press. 369-384 (2008).
  20. Thompson, H. J. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. J Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  21. Hamm, R. J., Pike, B. R., O'Dell, D. M., Lyeth, B. G., Jenkins, L. W. The rotarod test: an evaluation of its effectiveness in assessing motor deficits following traumatic brain injury. J Neurotrauma. 11, 187-196 (1994).
  22. Scherbel, U. Differential acute and chronic responses of tumor necrosis factor-deficient mice to experimental brain injury. Proc Natl Acad Sci. 96, 8721-8726 (1999).
  23. Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Nature. 297, 681-683 (1982).
  24. Stichel, C. C., Muller, H. W. The CNS lesion scar: new vistas on an old regeneration barrier. Cell Tissue Res. 294, 1-9 (1998).
  25. Brechot, N. Modulation of macrophage activation state protects tissue from necrosis during critical limb ischemia in thrombospondin-1-deficient mice. PLoS One. 3, e3950-e3950 (2008).
  26. Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behav Brain Res. 177, 347-357 (2007).
  27. Thompson, H. J. Cognitive evaluation of traumatically brain-injured rats using serial testing in the Morris water maze. Restor Neurol Neurosci. 24, 109-114 (2006).
  28. Doll, H. Pharyngeal selective brain cooling improves neurofunctional and neurocognitive outcome after fluid percussion brain injury in rats. Journal of neurotrauma. 26, 235-242 (2009).
  29. Fujimoto, S. T. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neuroscience and biobehavioral reviews. 28, 365-378 (2004).
  30. Carbonell, W. S., Maris, D. O., McCall, T., Grady, M. S. Adaptation of the fluid percussion injury model to the mouse. Journal of neurotrauma. 15, 217-229 (1998).

Comments

12 Comments

  1. Hi,
    I do this same procedure but am frustrated with the glue I use. DŒs the Loctite keep the trephine guide in place and dŒs it help keep the hub from wobbling and scooting around when you apply the dental acrylic?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:18 PM
  2. The loctite glue dŒs work well to keep the weed whacker circle afixed and the trephine from slipping around. We do not use the loctite glue to keep the hub in place. For that we use super glue gel and you do have to have a steady hand to prevent the hub from moving while applying the glue. Wait a minute for the glue gel to dry before applying the dental cement.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:17 PM
  3. Hi again,
    I'd also like to ask if the IV line that you use to connect the animal to the FPI device has any affect on the level of injury, the wave form, or if you have to make any adjustments to compensate for the additional length of the line?
    Thanks again for your time.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:23 PM
  4. The tubing we purchase is a fixed length. We assume that different lengths may affect the waveform which could be adjusted empirically with test pulses.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:29 PM
  5. Hi,
    I would like to ask you where did you purchase the trephine you used for the craniotomy?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 6:37 AM
  6. We got ours from the Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:17 AM
  7. Hi, thank you very much for the quick response;
    However, when I read Research Instrumentation Shop, I tried to google it, but I see that they are a very specific shop for your university.
    I am trying to perform some craniotomies in my mice using a dental drill, however it seems that your way is more efficient and less risky. Is there another way to obtain such trephine? It's a very delicate instrument that is very difficult to find. Do you have perhaps other alternatives?

    Thank you very much and sorry for the trouble

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:31 AM
  8. I am sorry, but i know of now other source than U of P. They are custom made and are made to order. I have found then to make a very clean window without any danger of heat-induced damage. I have also used trephines attached to microdrills with much less success. I am have also made window using these trephines for ²-photon imaging of live mice.



    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:31 AM
  9. I used to get mine from U. of Penn also, but I was told they no longer wanted to make them. I switched to using a pin vise from a hardware store, coupled with a trephine from FST, item # 18004-²7. I feel this works better than the ones from U. Penn, the pin vise is slightly larger so I have more to hold on to and therefore more control. Pin vises are inexpensive but you will need to replace them frequently because they eventually rust; they are not made to be autoclaved. Alternately, you could get one or two of them plated in nickel, which would eliminate the need to replace them. We have a shop here that dŒs that kind of work, I discussed this with them when I was switching from the U.Penn trephine to the Fine Science Tools type.
    Custom Design & Fabrication South, LLC
    ²²90 Spain Drive
    Petersburg, VA ²3805-8403
    (804) ²01-5471
    Hope this is helpful to you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:32 AM
  10. Thank you very much for the info and the concern

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:43 AM
  11. Terry,

    That is a very useful idea--I have a FST trephine that I have not used yet. I will give it a try.

    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:45 AM
  12. Very nice demo! Just a minor comment about anesthesia. Mouse respiration rate should be around 60 times/minute even under 100% O² during the surgery in order to minimize artifact on animals. This video showed that the mouse receiving surgery exhibited a very slow respiration, 5 to 6 seconds a time, namely about 1² times/minute, which indicated that anesthesia in this demo was too deep. If the conc of isoflurane is maintained between 1.1 to 1.4%, during the surgery, you should not have that problem.

    Reply
    Posted by: YeQing P.
    February 17, 2013 - 10:11 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics