横方向の流体のパーカッション:マウスにおける外傷性脳損傷のモデル

Neuroscience
 

Summary

横方向の流体パーカッション(LFP)、マウスの外傷性脳損傷の確立されたモデルは、実証される。妥当性、信頼性と臨床的関連:LFPは、動物モデルの3つの主要な基準を満たしています。外科的開頭で構成される手順は、ハブの固定は、焦点とびまん性傷害の結果、傷害の誘導が続く記述されています。

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Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063, doi:10.3791/3063 (2011).

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Abstract

外傷性脳損傷(TBI)の研究では、どの罹患率と死亡率の結果頭部外傷の意識の高まりにより、新たな勢いを、達成している。再生のプロセスの1,2に続いているTBI、複雑かつ異種の二次影響の結果、以下の一次的損傷の性質に基づく。一次的損傷は、頭蓋骨の骨折からまたはせん断と動き3,4に起因する脳の変位を引き起こす組織の伸張から脳への直接挫傷により誘導され得る。結果として得られる血腫と裂傷が血管反応3,5を引き起こす、と白質の形態学的および機能的な損傷は、軸索傷害6-8拡散につながる。一般的に脳に見られる追加の二次的変化は、浮腫や頭蓋内圧亢進9です。 TBIは、次の最終的に長期的な神経学的障害を13,14につながる興奮神経伝達物質、免疫メディエーターおよび酸素ラジカル10-12、の放出に関与する生化学および生理学的経路の微視的な変化があります。したがって、ヒトおよびげっ歯類に存在する同様の細胞や分子のイベントはTBIそのTBIの適切な動物モデルを選択すると、損傷および修復のメカニズムを研究するために重要です。

流体パーカッション、皮質への影響及び重量落下/衝撃加速度1:TBIの様々な実験モデルはヒトで観察TBIの局面を再現するために開発されている、それらの間の3つの特定のモデルが広くげっ歯類に適応されています。流体のパーカッションのデバイスは、そのまま硬膜への簡単な流体の圧力パルスを印加することによりクレイニエクトミによって傷害を生成します。パルスは、流体のリザーバーのピストンを打つ振り子によって作成されます。パーカッションは、神経組織1,15の簡単な変位や変形を生成します。逆に、皮質衝撃傷害は、空気圧16,17の下で厳格なインパクターを経由して無傷の硬膜への機械的エネルギーを提供します。重量落下/衝撃モデルは閉じた頭蓋骨18日に特定の質量を持つ棒の落下によって特徴付けられる。 TBIのモデルの中で、LFPは混合焦点とびまん性脳損傷19を評価するために最も確立されたと一般的に使用されるモデルです。それは再現可能であり、傷害のパラメータの操作を可能にするために標準化されています。 LFPの反復するの怪我は、このように、それが臨床的に関連するレンダリング、ヒトで観察し、臨床翻訳20の新規治療薬の探索が可能になります。

我々は、マウスでLFPの手順を実行するための詳細なプロトコルを記述する。与えた損傷は皮質、海馬および最も脆弱である脳梁のような脳の領域で、軽度から中等度です。海馬と運動学習のタスクは、LFPは、次の探索されます。

Protocol

1。クレイニエクトミ

  1. 無菌手術部位は手術中のイソフルランの連続的な吸入を可能にするためにO 2フラッシュ(パークランドサイエンティフィック)と麻酔器に接続されたマウスのガス麻酔ヘッドホルダー(Kopfはインスツルメンツ)とマウスの定位固定アライメント測定器(Kopfはインスツルメンツ)を含めて用意されています。温暖化のパッドは37℃に保た° Cは、手術中にマウスの下に配置されている。手術用顕微鏡と光源が必要です。実験者は実験用の上着、外科マスク、足カバー、手袋、およびヘッドのカバーを着用してください。手術部位に連絡して、すべてのツールや材料を滅菌する必要があります。
  2. ルアーのメス側で構成される傷害のハブは、、カミソリの刃で20 G 1 ½"針(Becton Dickinson社)の金属の端をカットすることによって作成されます。ハブは若干のバイアスを使ってカットする必要があると約3mm内径の開口部を持っている。トレフィンは(ステップ1.10を参照)、適切な直径の傷害のハブを測定し、製造するために使用することができます。Oneハブが動物ごとに必要とされる。ハブは頭蓋骨に接続されているとLFPに接続されます。圧力のパルスを供給する装置。
  3. 固体ナイロンコード(1.7mmの直径、例えば雑草のトリマーのライン)がカミソリの刃を用いて〜1mm厚のディスクに切断される。再び、あるディスクが動物ごとに必要です。これは、頭蓋骨切除術を行いながら(ステップ1.10を参照)トレパンを安定させるために使用されます。
  4. マウスは、任意のひずみと年齢( - 9ヶ月私たちは主にC57BL / 6の年齢1を使用)にすることができます。マウスは、少なくとも1分間の小さな誘導チャンバー(100%O 2におけるイソフルラン4から5パーセントであらかじめ設定)で計量し、麻酔されています。先制鎮痛のために、buprenorphrine(0.1 mg / kg)の注入は、腹腔内に与えられ、マウスを別の分のためのチャンバーに戻されます。鎮痛療法は、地元の動物の利用とケアの委員会との協議によって確認されるべきである。
  5. マウスの頭頂部の毛は、できるだけ皮膚の近くにトリミングされます。マウスは、揮発性ガス麻酔(Kopfは楽器を)管理するように設計一口メッキを装着した定位固定アライメント測定器内に位置している。イソフルランガスのレベルは2%にまたは効果に削減されます。呼吸率は、手術中に視覚的に監視されます。このような血液ガスのような他の生理的パラメータ(P O 2、P CO 2)、血液のpH値や血圧は、手順の間に適切な機器を用いて測定することができます。
  6. 人工涙液の潤滑剤の眼軟膏を乾燥からそれらを保つために綿棒を使用してマウスの目に置かれている。ポビドンヨードは、70%アルコールに続いて綿棒で目と首の間の皮膚に適用されます。ポビドンヨードやアルコールのアプリケーションは、3回の合計のために繰り返されます。
  7. 正中頭皮の切開は、目からメス(#15ブレード)と頭蓋骨を露出し、明確な手術野を提供するために、小さなブルドッグクランプ(ファイン科学のツール#18050から28)で撤回スキンを使用して首に行われます。ブルドッグクランプは、頭蓋骨の外側のエッジをオフにハングアップする。
  8. 局所麻酔薬ブピバカイン(生理食塩水0.025%)を綿棒や筋膜が歯のツールや骨のスクレーパー(例えば、ファイン科学ツール、#10075〜16)の先端で頭蓋骨から削られて頭蓋骨に適用されます。
  9. 永久的なマーカーを半ブレグマとラムダの間と右半球(正中線の右約2 mm)以上の矢状縫合と横方向の尾根の間に頭蓋骨をマークするために使用されます。ロックタイトシアノアクリレート接着剤(ロックタイト徳パック454)の低下はボートと側把持鉗子(ファイン科学のツール、デュモン#6)に雑草固体ナイロンコードのディスクを(上記1.3参照)ディップするために使用される重量プラスチックに入れているその後、接着剤とは、頭蓋骨上にマークでディスクを押してください。ロックタイトアクセラレータの1〜2滴は、接着剤の硬化を引き起こすことが1ミリリットル注射器と26 3 / 8 Gの針を使用して、ディスクの上に配信されます。次に進む前に、頭蓋骨にディスクの密着性をテストします。
  10. ディスク上の3ミリメートル外径トレフィンを(研究の計装屋、ペンシルバニア大学)を配置して、頭蓋骨を切ってまで、時計回りに回転します。遠く頭蓋骨と違反硬膜に穴を避けるために頻繁にトレパンの進捗状況を確認してください。ディスクの周囲に頭蓋骨が薄くなると頭蓋骨のフラップが軽く押されたときに緩んで感じることがあるでしょう。頭蓋骨の下てこと骨弁を持ち上げるために歯科用ツールがパラレル/頭蓋骨の表面に水平に置きます。鉗子で頭蓋骨から骨を切り離します。少量の出血が硬膜の妥協することなく、ある場合は、出血が停止するまで圧力を適用して硬膜になってから骨のほこりを防ぐために、綿棒を使用してください。しかし、ヘルニアが見えるよう硬膜の違反がある場合、動物は、人道的な安楽死による実験から除去されるべきである。このステップでは、十分な練習が必要です。必要な手術技能を実現する。
  11. ハブのバイアスが頭蓋骨(つまり、ハブの長辺は、頭蓋骨の外側稜線付近にある)の曲率に合うように鉗子を使用して、頭蓋骨のクレイニエクトミ以上の位置における傷害のハブを維持する。一方、鋭い先端を持つようにカミソリの刃で斜めにカット木の棒を、使用して、反対側の手でハブの外側の縁の周りにスーパー接着剤のゲルを適用し、それが穴に直立固定されるまで、ハブを安定化させる。ケアは、硬膜の上に接着剤を得ることにならないようにご注意ください。硬膜上に接着剤は、傷害の減衰が発生します。
  12. 小さな紙コップを使用して、粘稠な溶液を作成するには、メチルメタクリレート歯科アクリル(パーマの新しい線を引く/修理樹脂、バトラーシャインとジェットアクリルリキッド)を混ぜる。すべての傷害のハブの周囲にセメントを適用するために接続されていない針と1ccの注射器を使用してください。セメントは、傷害のハブの底部2ミリメートルだけでなく、周囲の露出頭蓋骨をカバーする必要があります。頭蓋骨の縫合糸は、負傷からの流体の塊は、頭蓋腔内に留まることを保証するためにセメントで密封されています。
  13. 注射器と平滑針を使用して滅菌0.9%のNaCl(食塩水)でハブを埋める。生理食塩水は、回復期に硬膜を湿った状態に維持されます。さらに、傷害のハブがいっぱいに滞在していない場合、それは頭蓋骨にハブ接続のリークを示すでしょうし、新しいハブを添付すること。マウスは、定位アライメント測定器から除去し、温暖化のプレート上にないワイヤーバーのふたで空のケージに入れ、滅菌生理食塩水IP 0.25mlの注入を与えられるべきである。ケージの底部にあるhydragelを置き、マウスが1〜2時間で回復することができます。

2。傷害の誘導

  1. LFPデバイスに接続されているオシロスコープ(テクトロニクスTDS 1001B、2チャンネルオンラインストレージオシロスコープ40MHzの、500Ms.s)とアンプ(トラウマのインデューサ圧力トランスデューサアンプ)の電源をオンにします。 LFPデバイス(カスタム設計と製作、バージニアコモンウェルス大学)とそれに接続して高圧のチューブ(長さ41センチメートル、ボリューム2ミリリットル、バクスター#2C5643)滅菌水で満たされたと気泡の自由されていることを確認します。チューブの端にはオス型ルアーロック部分です。チューブのルアーロック端を閉じた状態で、振り子を解放することによって、テストパルスを実現。デバイスは、約10のテストパルスを提供することによりプライミングされるべきである。その振り子を確認し、オシロスコープとアンプの上に滑らかな信号を与える。ノイズの多い信号では、傷害のパルスを配信する前に削除する必要がシステム内の空気を示している。パルスの持続時間は約20ミリ秒である必要があります。 LFPデバイスに付属の変換器のアンプは校正されてようが10mV =平方インチ当たり1.0ポンド(PSI)。 1気圧(ATM)= 14.7 PSI。反射回数と肺水腫に関連付けられている増加する死亡率を正すの範囲を生成するためには2.1気圧の - 配送傷害の圧力は0.9の範囲にある。 4分、0 - - 5%の死亡率は軽度の損傷は、2の立ち直り反射時間とみなされます。 10分および10 - - 20%の死亡率は中程度の傷害は、6の立ち直り反射時間とみなされます。必要に応じて、パルスの強度を増加または減少する振子の角度を調整する。振り子の開始位置の角度は約10度です。 LFPデバイスを調整した後、チューブのルアーロックエンドを開くようにしてください。
  2. マウスは、麻酔の外科平面に到達するまで4〜5パーセントイソフルラン麻酔チャンバー(プリチャージ)に配置されます。マウスは、LFPデバイスの隣にあるプラットフォーム上に配置され、ハブは、滅菌生理食塩水で満たされている。オスルアーロック付きLFPデバイスのチューブは、ハブのメスルアーロックフィッティングに接続されています。動物は、その側面と一度正常な呼吸パターンの再開に配置されますが、事前の完全な意識を(〜2分)回復動物に、LFPデバイスの振り子は、傷害の単一パルスを発生させる解放されます。それは呼吸不全や死を引き起こす可能性があるとして動物も麻酔のときに怪我​​を誘発しないことが重要です。パルスの正確な圧力を記録する必要があります。無傷、偽の動物が傷害を誘発するために、実際の流体のパルスを除いて、同じ手順のすべてを受ける。
  3. 動物はすぐにLFPデバイスから削除し、立ち直り反射の時間を監視するために、その裏面に配置する必要があります。マウス自体をrightedれた後、それが再び一時的に麻酔で、セメントとハブは手で頭蓋骨から一緒に削除されます。頭皮は、Vetbond組織接着剤(3M)、縫合糸またはステープルで閉じられます。ハブの硬膜または閉塞のいずれかのヘルニアが記載されています。閉塞ハブは、未知の大きさの減衰けがを生成します。その後外来とは、そのホームケージに戻されるまで、動物は、地球温暖化のパッドの上にケージに戻されます。

3。モータの評価、認知的および組織学的転帰

  1. MOLFPが原因でTorの赤字は、ロータロッドテスト、統合されたvestibulomotorと感覚運動機能21の指標を用いて決定することができます。すべての動物は、ベースライン値を決定し、パラダイムにマウスを順応する前に負傷してテストする必要があります。マウスは前の傷害〜2日間、1時間intertrial間隔とロータのデバイス上で1日3回を訓練されています。ゴム表面を持っている棒を、回転、36 mmの外径のバランスをとるため遅延が測定されます。速度は180秒間隔で4〜40 rpmに増加する。動物がロータロッドから落ちたときに、各試行は終了します。
  2. 傷害(通常は1、7、21日)は、次の異なる時点で、マウスは再びロータのデバイス上でテストされています。損傷後のロータロッド試験の評価は、そのベースラインのレイテンシ22に対して、個々のスコアに基づいています。負傷したマウスから落下するまでの平均待ち時間は、偽のマウスのそれと比較されます。
  3. 認知機能は、次LFPは、モリス水迷路(MWM)、げっ歯類23外傷後の空間学習とワーキングメモリの敏感な指標を用いてマウスの別のセットでテストすることができます。マウスは、パラダイムに順応し、4日間前に傷害に見えるプラットホームのテストを使用してベースラインの応答のためにテストされています。白い円形のプール(1 mの直径)は水と非毒性の白い塗料が充填されている。プラットフォームは、壁上にあるフラグまたはマーカーとなく視覚的な手がかりを用いて可視化される。試験4を介して、マウスが目に見えるプラットフォームのその反対側の象限に配置され、プラットフォームを見つけるためにレイテンシを測定する。最大試験時間は60秒であり、マウスが残るか、各試験の終了時に15秒のためのプラットフォーム上に配置されます。 intertrial間隔は、マウスが加熱パッドで温めている間5分です。プラットフォームは、各試験ごとに異なる​​象限に移動され、4つの試験が行われている。
  4. 学習評価するために、マウスが傷害(通常は1、7、21日)に続く種々の時点で4象限のいずれかで固定された隠されたプラットフォームを使用してMWMに訓練されている。黒と白の手がかりは、壁に配置されます。マウスが配置される象限は、擬似乱数的に訓練を通して変化させるとプラットフォームを見つけるために時間が記録されます。最大試験時間は60秒であり、マウスが残っているか15秒のためにプラットフォーム上に配置され、試験間で5分間温める。マウスは、3日間連続の8試験/日に供される。記憶の保持を評価するために、動物は最後のトレーニングの翌日60秒のプローブ試験に供される。プローブ試験中に、プラットフォームは、プラットフォームがために使用象限に費やされる時間と距離泳いだを決定するために削除されます。最後に、目に見えるプラットホームのテストが可能なモータと後の傷害を開発した視覚障害を排除するために行われます。
  5. LFP損傷の組織学的影響を決定するために、組織は0.9%で心臓内灌流により固定されている食塩は損傷後、目的の時点で4%パラホルムアルデヒドが続きます。組織は、一晩4接尾された℃で、次いで10%で凍結保護し、30%ショ糖と埋め込みソリューション。冷凍連続切片をクリオスタットで切断し、様々なimmuohistochemicalと組織学的手法を用いて処理されます。

4。代表的な結果:

LFPデバイスにより誘発される損傷は、特に十分な外科のトレーニングで、動物から動物に再現可能です。けがの一貫性を維持するために、デバイスによって硬膜に配信圧力の量が監視されます。振り子は、動物の頭蓋骨切除術のサイト(図1A)に貼付けがのハブに接続されている高圧チューブとルアーロックフィッティングと水で満たされたアクリルシリンダーを打つ。傷害を軽度から中等度の場合は、振り子の角度は0.9からの範囲の圧力を生成するように設定されています- 2.1気圧とアンプに接続してオシロスコープは、圧力パルス(図1B)を可視化するために使用されます。傷害は、反射回数と肺水腫に関連付けられている増加する死亡率を正すの範囲を生成します。 4分、0 - - 5%の死亡率は軽度の損傷は、2の立ち直り反射時間とみなされます。 10分および10 - - 20%の死亡率は中程度の傷害は、6の立ち直り反射時間とみなされます。また、LFPを受けたマウスは、てんかん発作を示すかもしれないトニック姿勢を示すことができる。発作は、しばしば危険にさらさ硬膜に関連付けられています。一緒に、これらの知見は、傷害が神経学的損傷の原因となっていることを示唆している。シャム動物はLFPデバイスに接続されていますが、振り子がリリースされていません。

LFPによって誘発される損傷を可視化するために、我々は、傷害に対する応答に関連付けられている細胞の種類が、どちらも星状膠細胞とマクロファージを認識する抗体を用いて免疫細胞化学を行った。グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)染色は、傷害WHの領域では皮質全体に増加グリオーシスを明らかにereas偽のマウスはクレイニエクトミ下記の同等のサイト(図2A、B)で増加した星状細胞増加症が表示されません。同様に、MAC1染色は、偽手術を受けたマウスと比較して損傷部位を取り巻く多くのマクロファージを示しています。さらに、ではなく、偽のマウス(図2C、D)でLFPを受けたマウスの可視皮質組織に頻繁に物理的な損傷があります。

軽度のLFPは、次の行動試験は、認知運動の成果の両方を評価するために使用することができます。 MWMは、学習と記憶への影響を決定するために使用されます。試験室での視覚的な手がかりを使用して、偽のマウスは、急速に水迷路での訓練の後続の各​​一日にプラットフォームを配置で、より効率的になりました。軽度のLFPを受けたマウスは、その後3日目(図3A)でタスクを学ぶように見える偽のマウスに対する相対的なテストの最初の2日間に隠されたプラットフォームを見つけるために時間がかかります。これらの知見は、傷害のマウスは空間学習の獲得できる割合を減少させることを示唆している。記憶の保持に対する傷害の影響を判断するには、プローブの試験は1日の最後のトレーニングセッションの後に行われます。偽のマウスは怪我が使われているプラットフォームが存在する場所の位置(図3B)をリコールするためにマウスの能力に影響を与えていることを示唆して軽度のLFPを受けたマウスと比較して、ターゲットの象限に多くの時間を過ごす。運動機能を評価するために、マウスがロータロッドデバイス上でテストされています。軽度のLFPを受けたマウスでは1,7、および21日後の傷害(解像度)(図3C)で偽のマウスに比べて落ちる短い平均待機時間を持っている。これらのデータは、負傷したマウスは統合されたvestibulomotorと感覚運動機能に障害のあることを示唆している。

図1
図1。LFPデバイスと傷害の間に得 ​​られたオシロスコープから代表的なトレース。 A)LFPデバイスのコンポーネントは、次のとおりです。振り子は、所望の力、高圧のチューブと接続されているオスルアーロックフィッティング、アンプとアクリルシリンダーを満たした水を供給する所定の角度でスタンドとセットに固定とオシロスコープ。オシロスコープからの圧力パルスのB)代表トレース。ピークツーピーク値は1.47気圧の圧力を示す2.16ボルトです。

図2
図2:LFP以下の強化された神経膠症と炎症反応は、傷害の程度を示しています。偽手術(A、C)またはLFPの損傷(B、D)7日後の傷害(解像度)を受けたマウスの脳を介して冷凍横断切片(20μmの)。皮質画像はクレイニエクトミの震源地で撮影されています。 (A、B)組織は、アストロサイトを識別する抗体で染色される。グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)抗体(MAB360、ケミコン、1:400)は、偽手術に比べてLFPの損傷(矢印)を受けたマウスの大脳皮質全体に星状膠細胞の高い数値を示している。二次抗体はヤギ抗マウス594(1:1000)である。 (C. D)組織はマクロファージを識別する抗体で染色される。 MAC1抗体(MAC1 -α鎖のCD11b、BD Biosciences社、1:50)偽手術と比較して(矢印)皮質の損傷部位の周囲に多くのmacrophgesおよび/または活性化したミクログリアを明らかにする。二次抗体はヤギ抗ラットCY3(1:50)です。スケールバーとBの=200μmの、CとDに100μmの

図3
図3。軽度のLFPは、次の行動試験は、偽のマウスと比較して負傷の赤字を示しています。 A)軽度のLFPを受けたマウスは、偽のマウスよりもMWMでプラットフォームを見つける作業を学ぶために時間がかかります。偽VS LFP(AVEの秒± SEM)1日34.21 ± 3.02対38.64 ± 2.63、2日目24.52 ± 2.84対27.21 ± 2.11、3日目22.47 ± 2.00対22.08 ± 2.52(1解像度、N = 9偽、10 LFP) 。 B)マウスは、偽のマウス(21解像度、N = 10)にMWM相対的に最後の訓練の後、プローブ試験24時間の間にターゲットの象限に少ない時間を過ごす穏やかなLFPを行った。 C)軽度のLFPを受けたマウスはすぐにロータロッド装置から落ちる偽のマウスに比べて(1、7、および21解像度、n = 5の偽の、8 LFP)。エラーバーはSEを表す。

Discussion

LFPの方法は、ここで紹介のneuropathalogicalと行動の成果の多くのモデルは、TBIの広く使用されている動物モデルとなった理由である外傷性脳損傷の軽度から中等度。この手法の妥当性と信頼性を向上させるために考慮すべきいくつかの重要なステップがあります。例えば、硬膜の完全性がクレイニエクトミ中に危険にさらされていないだけで、動物がLFPに供し、研究で使用することが重要です。クレイニエクトミは、任意の接着剤やセメントによって閉塞されている場合、さらに、クレイニエクトミ下硬膜のように一部が流体圧の力にさらされていない、動物は試験から除外されるべきである。最後に、立ち直り反射の時間や死亡率が所望の範囲内にない場合、動物は研究に含まれるべきではない。圧力パルスの強度は、より深刻な怪我を生成するために増加することができます。

図1に示すように、LFPデバイスの設定は比較的単純で、傷害の程度の再現性は、オシロスコープに圧力の雰囲気を監視することによって維持されています。オシロスコープのトレース上の曲線の滑ら​​かな形状は、LFPの傷害の誘導を妨害する可能性流体内に気泡がないことを示しています。テストパルスは、傷害を誘発する前に配信される必要がありますし、オシロスコープのトレースは、滑らかな曲線を示していない場合、気泡を削除する必要があります。パルスの持続時間は、衝突試験のシミュレーションで測定された誘導の時間を表す約20ミリ秒です。短いパルスの傷害はより多くの焦点怪我を生産する可能性があります。 TBIしたがって、パルスのモデルのこの期間は人間。

LFPを以下の形態学的および細胞の変化は、組織への物理的な損傷だけでなく、図2に示すようにアストロサイトとマクロファージ数の増加が含まれています。それは傷害の顕著な兆候の一つは、星状膠細胞とグリア瘢痕の形成の過形成であることが十分に確立されている。グリア瘢痕が有益と有害な影響24の両方を有することが示されている。同様に、マクロファージは、治癒のプロセスが25を開始したとき、位相は、次の怪我の間に様々な組織に蓄積することが知られている。このように偽のコントロールに対する相対LFP試料のGFAPとMAC​​1陽性細胞数の増加は、傷害の誘導の指標である。偽のコントロールで、これらの細胞特異的マーカーの発現の欠如は、単独で手術操作は脳組織の健康上およびタンパク質発現の変化は、傷害のパラダイムに固有の負の結果を持っていないことを示しています。

図3に示す軽度のLFPの行動結果は、認知や運動障害などがあります。 MWMの所見LFPマウスは、最終的にタスクを学ぶことを示しているが偽のマウスよりも遅い速度で、彼らは訓練の後だけでなく、一日の作業を覚えていません。このように、さらに軽度負傷マウスは、その後のテスト中に取得する必要が空間的な情報を、処理の統合、および格納するための外部手がかりを使ってで偽のマウスよりも効率的です。このような条件性恐怖反応のような他の海馬依存の認知タスクはLFP 26に受けたマウスでは損なわれることが示されている。最後に、軽度の損傷後の3週間にロータロッドパラダイムで偽のマウスの相対LFPマウスによって落下する短い待ち時間は、統合されたvestibulomotorと感覚運動機能の障害の指標です。他のグループ27から30によって示されているとして、より多くの中程度の傷害は、認知および運動機能のより顕著な変化を明らかにするだろう。

それが予想される基準の多くを満たしているため合計では、LFPは人間TBIの有効なモデルです。 LFPは、構成概念妥当性を提供するという点では、ヒトにおけるTBI誘導病因のプロセスを再作成します。具体的には、力と死亡率の大きさは、事前に怪我の外科的介入は、動物モデルに対して一意であることを警告と軽度および中等度のスポーツカー関連の負傷で発生しているものと同様である。 LFPはまた、人間のTBIで観測された解剖学的、生化学的、神経病理学的および行動への影響の多くのそのLFP反復するに顔の妥当性を示す。そこにLFP後に検出される焦点とびまん性変化の両方があり、インパクトの左右差は1つが対側のそれと怪我に同側での形態学的損傷を比較することができます。一つ注意点は、認知運動効果を1つだけの半球が負傷の結果として、より微妙な場合があることである。最後に、LFPは、予測的妥当性を示し、LFPの手法の信頼性は、傷害20の誘導の前または後に様々な薬理学的および遺伝的操作の評価が可能になります。このような血圧、血液のpHや血液などの生理学的変数ガスは、治療薬の作用機序を決定するために、テスト薬剤の存在下および非存在下で測定する必要があります。しかし、TBIのプライマリとセカンダリの影響の複雑な性質のため、それはすべての症状を緩和することができる単一の介入を識別することは困難な作業です。

LFPのテクニックの一つ将来の考慮事項は、流体15の振り子によって提供される力を校正するための必要性をなくし、そのような気泡のような運用上の変数を避けるために、マイクロプロセッサ制御、空気圧駆動機器を採用したマイクロ流体パーカッションの使用可能性があります。しかし、標準のLFPのアプローチは、より良い介入や治療につながるTBI以下のダメージと回復の分子メカニズムを探索するために信頼性とシンプルな手法であることが多くの研究者によって証明されています。

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgments

この作業は、脳損傷の研究でニュージャージー州委員会によって運営されている。

Materials

  • Stereotaxic alignment instrument for mice (Kopf Instruments)
  • Mouse gas anesthesia head holder (Kopf Instruments)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Buprenorphrine (Webster Animal Supply)
  • Refresh Lacri Lube eye ointment (Fisher)
  • Bupivacaine/Marcaine (Webster Animal Supply)
  • Povidone-iodine solution (Fisher)
  • 20 g 1 ½” needles (Becton Dickinson)
  • Scalpel blade (#15) and holder (Becton Dickinson)
  • Bulldog clamps (Fine Science Tools)
  • Dental tool or bone scraper (Fine Science Tools)
  • Side grasping forceps Dumont #6 (Fine Science Tools)
  • 3mm outer diameter trephine (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania)
  • Solid nylon cord (1.7 mm diameter, e.g. weed trimmer line)
  • Super glue gel
  • Loctite cyanoacrylate glue (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation)
  • Jet Acrylic Liquid (Butler Schein)
  • Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein)
  • Storage Oscilloscope TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix)
  • Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • LFP device (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • High-pressure tubing, length 41cm, volume 2ml (Baxter)
  • 3M Vetbond Tissue Adhesive (Fisher)

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References

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Comments

12 Comments

  1. Hi,
    I do this same procedure but am frustrated with the glue I use. DŒs the Loctite keep the trephine guide in place and dŒs it help keep the hub from wobbling and scooting around when you apply the dental acrylic?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:18 PM
  2. The loctite glue dŒs work well to keep the weed whacker circle afixed and the trephine from slipping around. We do not use the loctite glue to keep the hub in place. For that we use super glue gel and you do have to have a steady hand to prevent the hub from moving while applying the glue. Wait a minute for the glue gel to dry before applying the dental cement.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:17 PM
  3. Hi again,
    I'd also like to ask if the IV line that you use to connect the animal to the FPI device has any affect on the level of injury, the wave form, or if you have to make any adjustments to compensate for the additional length of the line?
    Thanks again for your time.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:23 PM
  4. The tubing we purchase is a fixed length. We assume that different lengths may affect the waveform which could be adjusted empirically with test pulses.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:29 PM
  5. Hi,
    I would like to ask you where did you purchase the trephine you used for the craniotomy?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 6:37 AM
  6. We got ours from the Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:17 AM
  7. Hi, thank you very much for the quick response;
    However, when I read Research Instrumentation Shop, I tried to google it, but I see that they are a very specific shop for your university.
    I am trying to perform some craniotomies in my mice using a dental drill, however it seems that your way is more efficient and less risky. Is there another way to obtain such trephine? It's a very delicate instrument that is very difficult to find. Do you have perhaps other alternatives?

    Thank you very much and sorry for the trouble

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:31 AM
  8. I am sorry, but i know of now other source than U of P. They are custom made and are made to order. I have found then to make a very clean window without any danger of heat-induced damage. I have also used trephines attached to microdrills with much less success. I am have also made window using these trephines for ²-photon imaging of live mice.



    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:31 AM
  9. I used to get mine from U. of Penn also, but I was told they no longer wanted to make them. I switched to using a pin vise from a hardware store, coupled with a trephine from FST, item # 18004-²7. I feel this works better than the ones from U. Penn, the pin vise is slightly larger so I have more to hold on to and therefore more control. Pin vises are inexpensive but you will need to replace them frequently because they eventually rust; they are not made to be autoclaved. Alternately, you could get one or two of them plated in nickel, which would eliminate the need to replace them. We have a shop here that dŒs that kind of work, I discussed this with them when I was switching from the U.Penn trephine to the Fine Science Tools type.
    Custom Design & Fabrication South, LLC
    ²²90 Spain Drive
    Petersburg, VA ²3805-8403
    (804) ²01-5471
    Hope this is helpful to you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:32 AM
  10. Thank you very much for the info and the concern

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:43 AM
  11. Terry,

    That is a very useful idea--I have a FST trephine that I have not used yet. I will give it a try.

    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:45 AM
  12. Very nice demo! Just a minor comment about anesthesia. Mouse respiration rate should be around 60 times/minute even under 100% O² during the surgery in order to minimize artifact on animals. This video showed that the mouse receiving surgery exhibited a very slow respiration, 5 to 6 seconds a time, namely about 1² times/minute, which indicated that anesthesia in this demo was too deep. If the conc of isoflurane is maintained between 1.1 to 1.4%, during the surgery, you should not have that problem.

    Reply
    Posted by: YeQing P.
    February 17, 2013 - 10:11 AM

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