Fluido laterale Percussioni: Modello delle lesioni cerebrali traumatiche nei topi

Neuroscience
 

Summary

Laterale fluido percussioni (LFP), un modello stabilito di lesioni cerebrali traumatiche nei topi, è dimostrato. LFP soddisfa tre criteri principali per i modelli animali: rilevanza validità, l'affidabilità e la clinica. La procedura, che consiste di craniotomia chirurgica, la fissazione del mozzo seguita da induzione di lesioni, con conseguente lesioni focali e diffuse, è descritto.

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Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063, doi:10.3791/3063 (2011).

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Abstract

Lesioni traumatiche cerebrali (TBI), la ricerca ha raggiunto slancio rinnovato a causa della crescente consapevolezza di lesioni alla testa, che si traducono in morbilità e mortalità. In base alla natura del danno primario in seguito al trauma cranico, complessi ed eterogenei risultato secondario conseguenze, che sono seguiti da 1,2 processi rigenerativi. Lesione primaria può essere indotta da una contusione diretta al cervello da frattura del cranio o da taglio e stiramento del tessuto che causa lo spostamento del cervello dovute al movimento 3,4. La risultante ematomi e lacerazioni provocare una risposta vascolare 3,5, e il danno morfologico e funzionale della sostanza bianca porta al danno assonale diffuso 6-8. Ulteriori cambiamenti secondari comunemente osservati nel cervello sono edema e aumento della pressione intracranica 9. A seguito di trauma cranico non ci sono alterazioni microscopiche vie biochimiche e fisiologiche che comportano il rilascio di neurotrasmettitori eccitotossico, mediatori immunitari e radicali di ossigeno 10-12, che alla fine provocano disabilità neurologica a lungo termine 13,14. Così la scelta di modelli animali appropriati TBI che presentano simili eventi cellulari e molecolari in TBI umani e roditori è fondamentale per lo studio dei meccanismi alla base della lesione e di riparazione.

Vari modelli sperimentali di trauma cranico sono stati sviluppati per riprodurre gli aspetti del trauma cranico osservati negli esseri umani, tra cui tre modelli specifici sono ampiamente adattato per roditori: percussioni fluido, impatto corticale e calo di peso / impatto accelerazione 1. Il dispositivo percussioni fluido produce una ferita attraverso una craniectomia applicando un breve impulso di pressione del fluido al intatto dura. L'impulso è stato creato da un pendolo colpisce il pistone di un serbatoio di liquido. La percussione produce spostamenti brevi e deformazioni del tessuto neurale 1,15. Al contrario, lesioni corticali impatto fornisce energia meccanica al intatta durata attraverso un pendolo rigido sotto pressione pneumatici 16,17. La caduta / impatto modello peso è caratterizzato dalla caduta di una canna con un peso specifico sul cranio chiuso 18. Tra i modelli TBI, LFP è il modello più affermati e comunemente usato per valutare miste danno cerebrale focale e diffuso 19. È riproducibile e standardizzato per consentire la manipolazione dei parametri di lesioni. Ricapitola LFP lesioni osservate negli esseri umani, rendendo così lo clinicamente rilevanti, e permette l'esplorazione di nuove terapie per la traduzione clinica 20.

Noi descriviamo il protocollo dettagliato per eseguire procedura LFP nei topi. Il danno inflitto è da lieve a moderata, con le regioni cerebrali come corteccia, ippocampo e del corpo calloso è più vulnerabile. Compiti di apprendimento ippocampale ed il motore sono esplorate le seguenti LFP.

Protocol

1. Craniectomia

  1. Un sito chirurgico sterile è preparato anche uno strumento di allineamento stereotassico (Strumenti Kopf) per i topi con un supporto per mouse testa gas anestesia (Kopf Instruments) collegato ad una macchina per anestesia con O 2 a filo (Parkland scientifico) per consentire l'inalazione continua di isoflurano durante l'intervento chirurgico . Un blocco del riscaldamento a 37 ° C è posizionata sotto il mouse durante l'intervento. Un microscopio operatorio e la sorgente luminosa è necessario. Lo sperimentatore deve indossare un camice, mascherina, coprendo a piedi, guanti e copricapo. Tutti gli strumenti e materiali che contattare il sito chirurgico devono essere sterilizzati.
  2. Un hub lesioni, composto alla fine di una femmina luer-lok, viene creato tagliando la fine di metallo di una 20 g 1 ½ "ago (Becton Dickinson) con una lama di rasoio. L'hub dovrebbe essere tagliata con una distorsione leggera e hanno un'apertura di circa 3 mm di diametro interno. Il trapano (vedi punto 1.10) può essere utilizzato per misurare e fabbricare un hub lesione del diametro corretto. Un hub è richiesto per animale. L'hub sarà allegato al cranio e collegato alla LFP dispositivo per fornire il polso della pressione.
  3. Corda di nylon solido (1,7 mm di diametro, ad esempio, erbaccia linea trimmer) viene tagliata in dischi ~ 1 mm di spessore con una lama di rasoio. Ancora una volta, un disco è necessario per animale. Questo è utilizzato per stabilizzare il trapano durante l'esecuzione del craniectomia (vedere il punto 1.10).
  4. I topi possono essere di qualsiasi ceppo ed età (si utilizzano principalmente C57BL / 6 età 1-9 mesi). Il mouse viene pesato e anestetizzato in una camera di induzione di piccole dimensioni (pre-riempite con 4-5% isoflurano nel 100% O 2) per almeno 1 minuto. Per l'analgesia preventiva, una iniezione di buprenorphrine (0,1 mg / kg) è dato per via intraperitoneale e il mouse è posizionato nuovamente nella camera per un altro minuto. Regime analgesico deve essere confermata da una consultazione con l'utilizzo degli animali locali e comitato di cura.
  5. Il pelo sulla parte superiore della testa del mouse viene rifilato il più vicino alla pelle possibile. Il mouse è posizionato in uno strumento di allineamento stereotassico dotato di morso placcato progettato per amministrare anestesia volatili gas (Kopf Instruments). Il livello del gas isoflurano è ridotto al 2% o di effetto. Tasso di respirazione è monitorato visivamente durante l'intervento. Altri parametri fisiologici come il gas del sangue (p O 2, p CO 2), pH del sangue o della pressione arteriosa può essere misurata utilizzando attrezzature adeguate durante la procedura.
  6. Lacrime artificiali lubrificante unguento occhio è messo sugli occhi del mouse utilizzando un applicatore di cotone per evitare che l'essiccazione. Povidone-iodio viene applicato alla pelle tra gli occhi e il collo con un applicatore di cotone seguita da 70% di alcol. L'applicazione di povidone-iodio e alcol viene ripetuto per un totale di 3 volte.
  7. Una incisione del cuoio capelluto linea mediana è composta dagli occhi al collo con un bisturi (# 15 lama) e la pelle ritratta con un bulldog pinze di piccole dimensioni (strumenti di Scienze Belle # 18050-28) per esporre il cranio e fornire un chiaro campo chirurgico. I morsetti bulldog appendere i bordi laterali del cranio.
  8. Anestetico locale bupivacaina (0,025% in soluzione salina) viene applicata al cranio con un applicatore di cotone e la fascia è raschiato dal cranio con la punta di strumento dentali o raschietto osseo (per esempio, strumenti Scienza Fine, # 10075-16).
  9. Un pennarello indelebile è usato per marcare il cranio a metà strada tra bregma e lambda e tra la sutura sagittale e la cresta laterale sopra l'emisfero destro (~ 2 mm a destra della linea mediana). Una goccia di Loctite collante cianoacrilato (Loctite Tak Pak 454) è messo in una pinza di plastica pesa in barca e sul lato afferrare (Strumenti Scienza Fine, Dumont # 6) sono utilizzati per immergere un disco d'erba filo di nylon solido (vedi 1.3) nel colla e quindi premere il disco sul segno sul cranio. Uno o due gocce di Loctite Accelerator è espresso il superiore del disco utilizzando una siringa da 1 ml e 26 3 / 8 ago G a causare l'indurimento della colla. Aderenza prova del disco al cranio prima di procedere.
  10. Posto da 3 mm diametro esterno trapano (Negozio Strumentazione Research, University of Pennsylvania) il disco e girare in senso orario fino a quando hanno tagliato attraverso cranio. Verificare i progressi del trapano è frequentemente per evitare di arrivare troppo lontano nel cranio e violazione della dura. Ci sarà un assottigliamento del cranio intorno al perimetro del disco e il lembo cranio si sentiranno sciolti quando viene premuto leggermente. Posizionare lo strumento dentale parallelo / orizzontale alla superficie del cranio per fare leva sotto il cranio e sollevare il lembo osseo in su. Staccare l'osso dal cranio con una pinza. Se c'è una piccola quantità di sanguinamento, senza compromessi della dura, utilizzare un applicatore di cotone per applicare una pressione fino a quando l'emorragia si ferma e evitare che la polvere delle ossa di ottenere sulla dura. Tuttavia, se vi è una breccia nella dura tale che ernia è visibile, l'animale deve essere eliminato dal esperimento eutanasia umano. Questa fase richiede una pratica sufficienteper raggiungere l'abilità chirurgica necessaria.
  11. Utilizzando pinze, mantenere l'hub lesioni in posizione sopra il craniectomia nel cranio in modo che il bias del mozzo sia allineato con la curvatura del cranio (cioè il bordo più lungo del mozzo si trova vicino al crinale laterale del cranio). Nel frattempo, usando un bastone di legno, tagliato ad un angolo con una lama di rasoio per avere una punta acuminata, applicare il gel super-colla intorno ai bordi esterni del mozzo con la mano opposta e stabilizzare il mozzo fino a quando non è apposta in posizione verticale sopra il foro. Bisogna fare attenzione a non ottenere colla sulla parte superiore della dura. Colla sulla durata causerà un'attenuazione del danno.
  12. Usando una piccola tazza di carta, mix metil-metacrilato acrilico dentale (Jet liquido acrilico con Perm Reline / riparazione in resina, Butler Schein) per creare una soluzione viscosa. Utilizzare una siringa da 1 cc senza ago inserito da applicare cemento in tutto il mozzo lesioni. Il cemento dovrebbe coprire il fondo 2 mm di mozzo danni così come il cranio circostante esposta. Le suture del cranio sono sigillati con il cemento per garantire che il bolo liquido dalla ferita rimane all'interno della cavità cranica.
  13. Riempire il mozzo con salina allo 0,9% di NaCl (soluzione fisiologica) utilizzando una siringa e l'ago smussati. La soluzione salina non mancherà di tenere umida la durata durante la fase di recupero. Inoltre, se l'hub infortunio non rimane piena, che indica una perdita nella connessione hub al cranio e un nuovo hub dovrebbe essere fissata. Il mouse deve essere dato un iniezione di 0,25 ml di soluzione fisiologica sterile IP, rimosso dallo strumento di allineamento stereotassica e messo in una gabbia vuota, senza coperchio filo bar su una piastra di riscaldamento. Mettere alcuni HydraGel sul fondo della gabbia e permettere al mouse di recuperare per 1-2 ore.

2. L'induzione di lesioni

  1. Accendere l'oscilloscopio (Tektronix TDS 1001B, due canali oscilloscopio a memoria Digi 40 MHz, 500Ms.s) e amplificatore (induttore Trauma amplificatore trasduttore di pressione) che è collegato al dispositivo LFP. Verificare che il dispositivo LFP (progettazione e produzione personalizzati, Virginia Commonwealth University) e l'alta pressione tubi (lunghezza 41 centimetri, volume 2 ml, Baxter # 2C5643) ad esso collegati sono riempite con acqua sterile e priva di bolle d'aria. Alla fine del tubo è un maschio Luer-lok pezzo. Con il Luer-lok un'estremità del tubo chiuso, fornire impulsi di prova rilasciando il pendolo. L'apparecchio deve essere innescato da consegnare circa 10 impulsi di prova. Verificare che pendolo dà segnale liscio sull'oscilloscopio e amplificatore. Un segnale rumore indica aria nel sistema che deve essere rimossa prima di fornire l'impulso di lesioni. La durata dell'impulso dovrebbe essere di circa 20 msec. L'amplificatore trasduttore in dotazione con il dispositivo LFP è calibrato in modo tale che 10 mV = 1,0 libbre per pollice quadrato (PSI). Un atmosfera (ATM) = 14.7 PSI. Pressioni lesioni consegnati sono tipicamente nel range di 0,9-2,1 atmosfere di produrre una gamma di raddrizzamento tempi di riflesso e di un aumento della mortalità associato con edema polmonare. Lieve lesione è considerata un tempo riflesso di raddrizzamento di 2 - 4 minuti e un 0 - tasso di mortalità del 5%. Lesioni non gravi è considerato un tempo riflesso di raddrizzamento di 6 - 10 min e 10 - tasso di mortalità del 20%. Se necessario, regolare l'angolo del pendolo per aumentare o diminuire l'intensità del polso. L'angolo della posizione di partenza del pendolo è di circa 10 gradi. Dopo aver regolato il dispositivo LFP, assicurarsi di aprire la Luer-Lok un'estremità del tubo.
  2. Il mouse si trova nella camera di anestesia 4-5% isoflurano (precaricata) fino a quando un aereo chirurgico di anestesia viene raggiunto. Il mouse è posizionato su una piattaforma accanto alla periferica LFP e l'hub è pieno di soluzione salina sterile. Il tubo del dispositivo LFP con un maschio Luer-Lok è attaccato alla femmina Luer-Lok montaggio del mozzo. L'animale viene posto su un lato e una volta alla normale riprende la respirazione, ma prima che l'animale ha ripreso coscienza completa (~ 2 min), il pendolo del dispositivo LFP viene rilasciato per causare un singolo impulso di lesioni. E 'importante non indurre la lesione, mentre l'animale è troppo anestetizzata in quanto potrebbe causare insufficienza respiratoria e morte. La pressione esatta del polso deve essere registrato. Illeso, gli animali farsa subiscono tutte le stesse procedure con l'eccezione degli impulsi fluido reale per indurre lesioni.
  3. L'animale deve essere immediatamente rimosso dal dispositivo LFP e collocato sul dorso di monitorare il tempo riflesso di raddrizzamento. Dopo il mouse si è raddrizzato, è poi brevemente anestetizzato di nuovo e il cemento e mozzo rimosso insieme dal cranio a mano. Il cuoio capelluto è poi chiuso con tessuto adesivo Vetbond (3M), sutura o graffette. Qualsiasi ernia della dura o occlusione del mozzo è notata. Un hub occluso produrrà un infortunio attenuato di grandezza sconosciuta. L'animale è reinserito nella gabbia su un blocco riscaldamento fino ambulatoriale e poi tornò a casa sua gabbia.

3. Valutazione del motore, gli esiti cognitivi e istologici

  1. Il motor deficit causato dalla LFP può essere determinata utilizzando il test rotarod, un indicatore di vestibulomotor integrato e la funzione sensomotoria 21. Tutti gli animali devono essere testati prima di lesioni per determinare una lettura di base e per acclimatare i topi al paradigma. I topi sono addestrati sul dispositivo rotarod 3 volte al giorno con intervalli tra le prove di 1 ora per i due giorni precedenti l'infortunio. La latenza di equilibrio su un 36 mm di diametro esterno, ruotando asta, che ha una superficie di gomma è misurato. La velocità aumenta 4-40 giri in un intervallo di 180 sec. Ogni processo si conclude quando l'animale cade il rotarod.
  2. In diversi momenti dopo un trauma (tipicamente 1, 7 e 21 giorni), i topi sono di nuovo testati sul dispositivo rotarod. Valutazione dei test rotarod dopo l'infortunio si basa sui punteggi individuali relativi alla loro latenze di base 22. La latenza media di caduta di topi feriti è confrontata con quella di topi farsa.
  3. LFP funzione cognitiva seguenti possono essere testato su un gruppo separato di topi usando il Morris water maze (MWM), una misura sensibile post-traumatico di memoria spaziale di apprendimento e di lavoro nei roditori 23. I topi sono acclimatati al paradigma e testati per la risposta di base utilizzando una prova visibile piattaforma 4 giorni prima per infortunio. Una piscina circolare bianco (1 m di diametro) è riempito di acqua e non tossico vernice bianca. La piattaforma è reso visibile con una bandiera o marker e senza segnali visivi sono sulle pareti. Più di 4 prove, il mouse è posizionato nel quadrante opposto a quello della piattaforma visibile, e la latenza per trovare la piattaforma viene misurato. Cronometro massimo è di 60 secondi e il mouse rimane o viene posizionato sulla piattaforma per 15 secondi alla fine di ogni prova. L'intervallo tra le prove è di 5 minuti durante il quale viene riscaldato il mouse su una piastra elettrica. La piattaforma è spostato in un quadrante diverso per ogni prova e quattro le prove vengono eseguite.
  4. Per valutare l'apprendimento, i topi sono addestrati sul MWM utilizzando una piattaforma fissa nascosta in uno dei 4 quadranti in vari momenti dopo un trauma (in genere 1, 7 e 21 giorni). Spunti in bianco e nero sono posti sulle pareti. Il quadrante in cui è collocato il mouse è pseudorandomly varia per tutta la formazione e il tempo per individuare la piattaforma è registrato. Cronometro massimo è di 60 secondi e il mouse rimane o viene posizionato sulla piattaforma per 15 secondi e riscaldato per 5 minuti tra le prove. I topi sono sottoposti a 8 prove / die per 3 giorni consecutivi. Per valutare la conservazione della memoria, gli animali sono sottoposti ad una prova di 60 sec sonda il giorno successivo la formazione all'ultimo. Durante il processo della sonda, la piattaforma viene rimosso per determinare il tempo trascorso e la distanza nuotato nel quadrante in cui la piattaforma di una volta. Infine, un test piattaforma visibile è fatto per escludere possibili motori e deficit visivo che si sono sviluppate dopo la lesione.
  5. Per determinare le conseguenze di lesioni istologiche LFP, il tessuto è fissato per perfusione intracardial nello 0,9% di NaCl, seguito da 4% paraformaldeide in punti di tempo desiderato dopo l'infortunio. Tessuto è postfixed notte a 4 ° C e poi crioprotetti nel 10% e 30% di soluzione di saccarosio e incorporamento. Congelati sezioni seriali sono tagliati su un criostato e trattati con varie tecniche immuohistochemical e istologici.

4. Rappresentante dei risultati:

Il danno indotto dal dispositivo LFP è riproducibile da animale ad animale, in particolare con sufficiente formazione chirurgica. Per mantenere la consistenza del pregiudizio, la quantità di pressione consegnato la dura dal dispositivo viene monitorata. Il pendolo colpisce un cilindro pieno d'acqua acrilico ad alta pressione e tubi di raccordo Luer-lok che è collegato al mozzo lesioni apposta sul sito craniectomia sull'animale (Figura 1A). Per una ferita lieve a moderata, l'angolo del pendolo è impostato per generare una pressione che va dal 0,9-2,1 atm e un oscilloscopio collegato ad un amplificatore è usato per visualizzare l'impulso di pressione (Figura 1B). Lesione produce una gamma di raddrizzamento volte reflex e una mortalità maggiore associata con edema polmonare. Lieve lesione è considerata un tempo riflesso di raddrizzamento di 2 - 4 minuti e un 0 - tasso di mortalità del 5%. Lesioni non gravi è considerato un tempo riflesso di raddrizzamento di 6 - 10 min e 10 - tasso di mortalità del 20%. Inoltre, i topi sottoposti a LFP possono mostrare atteggiamenti tonico che può essere indicativo di sequestro. Il sequestro è spesso associato ad un compromesso dura. Insieme, questi risultati suggeriscono che il danno sta provocando danni neurologici. Animali Sham sono collegati al dispositivo LFP, ma il pendolo non viene rilasciato.

Per visualizzare i danni indotti dalla LFP, abbiamo svolto immunocitochimica con anticorpi che riconoscono gli astrociti e macrofagi che sono entrambi tipi di cellule associate con una risposta al danno. Proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) colorazione rivela gliosi rafforzate in tutta la corteccia nella regione di lesioni whereas topi sham non vengono visualizzati astrocitosi aumentato nel sito equivalente al di sotto del craniectomia (Figura 2A, B). Allo stesso modo, MAC1 colorazione dimostra più macrofagi che circondano il luogo della ferita rispetto ai topi sottoposti a chirurgia farsa. Inoltre, vi è un danno fisico frequentemente al tessuto corticale visibile nei topi sottoposti a LFP ma non nei topi sham (Figura 2C, D).

Test comportamentali seguenti LFP mite possono essere usati per valutare sia gli esiti cognitivi e motori. MWM viene utilizzato per determinare gli effetti sull'apprendimento e la memoria. Utilizzando segnali visivi in ​​sala prove, i topi sham rapidamente diventato più efficiente a localizzare la piattaforma con ogni giorno successivo di formazione nel labirinto d'acqua. I topi sottoposti a LFP mite richiedere più tempo per individuare la piattaforma nascosta nei primi due giorni di test rispetto a topi farsa, ma poi sembrano imparare il compito entro il terzo giorno (Figura 3A). Questi risultati suggeriscono che la lesione riduce la velocità con cui i topi in grado di acquisire apprendimento spaziale. Per determinare l'effetto di lesioni sulla conservazione della memoria, un processo sonda viene eseguita 1 giorno dopo l'ultimo allenamento. Topi Sham trascorrere più tempo nel quadrante target rispetto ai topi sottoposti a LFP mite suggerendo che la lesione ha colpito la capacità dei topi a recuperare la posizione in cui la piattaforma utilizzata per residenza (Figura 3B). Per valutare la funzionalità dell'apparato locomotore, i topi sono stati testati sul dispositivo rotarod. I topi sottoposti a LFP mite hanno più breve latenza media di cadere rispetto ai topi farsa a 1, 7 e 21 giorni dopo l'infortunio (dpi) (Figura 3C). Questi dati suggeriscono che i topi feriti hanno alterato vestibulomotor integrato e la funzione senso-motoria.

Figura 1
Figura 1. LFP dispositivo e una traccia rappresentante dall'oscilloscopio ottenuto durante lesioni. A) I componenti del dispositivo sono LFP: il pendolo fissato ad un supporto e fissato in un angolo predeterminato per fornire la forza desiderata, un cilindro pieno d'acqua acrilico con tubi ad alta pressione e un maschio Luer-lok montaggio allegate, un amplificatore, e un oscilloscopio. B) traccia rappresentante di impulso di pressione da oscilloscopio. Il picco-picco valore è 2,16 volt che indicano una pressione di 1,47 atm.

Figura 2
Figura 2. Gliosi avanzata e una risposta infiammatoria a seguito LFP dimostra l'entità della lesione. Congelati sezioni trasversali (20μm) attraverso il cervello di un topo sottoposto a intervento chirurgico farsa (A, C) o lesioni LFP (B, D) 7 giorni dopo l'infortunio (dpi). Corticale immagini sono prese a l'epicentro della craniectomia. (A, B) del tessuto è colorato con un anticorpo per identificare gli astrociti. Proteina acida gliale fibrillare (GFAP) anticorpi (MAB360, Chemicon, 1:400) rivela un maggior numero di astrociti in tutta la corteccia del mouse sottoposto a lesioni LFP (frecce) rispetto alla chirurgia farsa. Anticorpo secondario è capra anti-topo 594 (1:1000). (C. D) del tessuto è colorato con un anticorpo per identificare i macrofagi. MAC1 anticorpi (MAC1-alfa catena CD11b, BD Biosciences, 1:50) rivela più macrophges e / o microglia attivata attorno al sito di lesione della corteccia (frecce) rispetto alla chirurgia farsa. Anticorpo secondario è ratto capra anti CY3 (1:50). Barra di scala = 200μm in A e B, 100μm in C e D.

Figura 3
Figura 3. Test comportamentali seguenti LFP mite dimostra deficit feriti rispetto ai topi farsa. A) I topi sottoposti a LFP mite richiedere più tempo per imparare il compito di trovare la piattaforma nel MWM rispetto ai topi farsa. Sham vs LFP (secondi ave ± SEM) 1 giorno 34,21 ± 3,02 vs 38,64 ± 2,63; 2 giorni 24,52 ± 2,84 vs 27,21 ± 2,11; 3 giorni 22,47 ± 2,00 vs 22,08 ± 2,52 (1 dpi, n = 9 farsa, 10 LFP) . B) I topi sottoposti a LFP mite spendere meno tempo nel quadrante bersaglio durante la sonda di prova 24 ore dopo l'ultimo allenamento nel relativo MWM ai topi sham (21 dpi, n = 10). C) I topi sottoposti a LFP mite cadere il dispositivo rotarod prima di topi sham (1, 7, e 21 dpi, n = 5 farsa, 8 LFP). Barre di errore rappresentano SE.

Discussion

Il metodo LFP qui presentati molti modelli degli esiti neuropathalogical e comportamentali di lieve a moderata lesione traumatica cerebrale è per questo che è diventato un modello animale ampiamente utilizzato di trauma cranico. Ci sono diversi punti critici da considerare al fine di aumentare la validità e l'affidabilità di questa tecnica. Per esempio, è importante che solo gli animali in cui l'integrità della dura non è stata compromessa durante il craniectomia essere sottoposto a LFP e usati nello studio. Inoltre, se il craniectomia è occlusa da qualsiasi colla o cemento in modo tale che una parte della dura sotto il craniectomia non è esposto alla forza della pressione del fluido, l'animale deve essere eliminato dallo studio. Infine, se il tempo riflesso di raddrizzamento o tasso di mortalità non è compreso nell'intervallo desiderato, l'animale non devono essere inclusi nello studio. L'intensità della pulsazione pressione può essere aumentata fino a generare le lesioni più gravi.

Come mostrato nella Figura 1, la configurazione del dispositivo LFP è relativamente semplice e la riproducibilità del grado di lesione è mantenuta attraverso il monitoraggio delle atmosfere di pressione sul oscilloscopio. La forma morbida della curva sulla traccia oscilloscopio indica che non vi siano bolle d'aria nel liquido che potrebbe interferire con l'induzione della lesione LFP. Un impulso di prova deve essere consegnato prima di indurre lesioni e se la traccia dell'oscilloscopio non presenta una curva dolce, le bolle d'aria devono essere rimosse. La durata dell'impulso è di circa 20 msec, che rappresenta il tempo di induzione misurato in simulazioni di crash test. Lesioni di brevi impulsi sono in grado di produrre lesioni più focali. Pertanto, questa durata di modelli impulso umano trauma cranico.

I cambiamenti morfologici e cellulari seguente LFP comprendono danni fisici al tessuto così come aumento del numero di astrociti e macrofagi, come dimostrato nella Figura 2. E 'ben noto che uno dei segni di lesione caratteristica è l'iperplasia degli astrociti e la formazione di una cicatrice gliale. La cicatrice gliale ha dimostrato di avere sia effetti benefici e dannosi 24. Allo stesso modo, i macrofagi si accumulano in vari tessuti durante l'infortunio seguente fase in cui il processo di guarigione inizia 25. Così l'aumento del numero di GFAP e MAC1 cellule positive nei campioni LFP relativa ai controlli farsa è indicativo della induzione di lesioni. La mancanza di espressione di tali marcatori cellulari specifici controlli farsa indica che le manipolazioni chirurgiche da soli non hanno conseguenze negative sulla salute del tessuto cerebrale e che i cambiamenti nell'espressione delle proteine ​​sono specifici per il paradigma lesioni.

Le conseguenze comportamentali della LFP mite illustrato in Figura 3 sono deficit cognitivi e motori. I risultati MWM indicano che i topi LFP finalmente imparare il compito, ma ad un ritmo più lento rispetto ai topi sham e non mi ricordo il compito e un giorno dopo l'allenamento. Così, anche i topi leggermente feriti sono meno efficienti rispetto ai topi sham a utilizzando i riferimenti esterni al processo, consolidare e conservare l'informazione territoriale, che deve essere recuperato durante le prove successive. Altri compiti cognitivi ippocampo-dipendenti, come risposta alla paura condizionata hanno dimostrato di essere ridotta nei topi sottoposti a LFP 26. Infine, la latenza più breve per cadere dai topi LFP rispetto a topi farsa nel paradigma rotarod fino a 3 settimane dopo la lieve lesione è un indicatore di deficit in vestibulomotor integrato e funzione senso-motoria. Una lesione più moderato avrebbe rivelato i cambiamenti più sorprendenti delle funzioni cognitive e motorie, come è stato dimostrato da altri gruppi 27-30.

In sintesi, la LFP è un modello valido per trauma cranico umano perché soddisfa molti dei criteri previsti. LFP fornisce validità di costrutto, in quanto ricrea i processi eziologici che inducono TBI negli esseri umani. In particolare, l'intensità della forza e tasso di mortalità è simile a quello che avviene negli sport lieve e moderata e lesioni legate auto con l'avvertenza che gli interventi chirurgici prima dell'incidente sono unici al modello animale. LFP anche mostre validità faccia che ricapitola LFP molte delle caratteristiche anatomiche, biochimiche, gli effetti neuropatologici e comportamentali osservati in TBI umano. Ci sono sia i cambiamenti focali e diffuse rilevato dopo LFP e la lateralizzazione degli effetti permette di confrontare il danno morfologico sul lato ipsilaterale alla lesione a quella sul lato controlaterale. Un avvertimento è che gli effetti cognitivi e motori possono essere più sottili a causa del ferimento di un solo emisfero. Infine, LFP mostra validità predittiva e l'affidabilità della tecnica LFP consente la valutazione delle varie manipolazioni farmacologiche e genetiche prima o dopo l'induzione di lesioni 20. Variabili fisiologiche come la pressione sanguigna, del pH del sangue e il sanguegas dovrà essere misurata in presenza e in assenza di un farmaco di prova per determinare il meccanismo d'azione di un agente terapeutico. Tuttavia, a causa della complessa natura delle conseguenze primarie e secondarie di TBI, è un compito difficile identificare un singolo intervento in grado di attenuare tutti i sintomi.

Una considerazione futuro per la tecnica LFP può essere l'uso di micro-liquido a percussione che si avvale di un microprocessore, strumento ad azionamento pneumatico per eliminare la necessità di calibrare la forza espresso dal pendolo e per evitare variabili operative, come bolle d'aria nel liquido 15 . Tuttavia, l'approccio LFP standard è stato dimostrato da molti ricercatori ad essere una tecnica affidabile e semplice per esplorare i meccanismi molecolari alla base del danno e di recupero dopo TBI che porterà a una migliore interventi e terapie.

Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Questo lavoro è finanziato dal New Jersey Commissione sulla ricerca Lesione Cerebrale.

Materials

  • Stereotaxic alignment instrument for mice (Kopf Instruments)
  • Mouse gas anesthesia head holder (Kopf Instruments)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Buprenorphrine (Webster Animal Supply)
  • Refresh Lacri Lube eye ointment (Fisher)
  • Bupivacaine/Marcaine (Webster Animal Supply)
  • Povidone-iodine solution (Fisher)
  • 20 g 1 ½” needles (Becton Dickinson)
  • Scalpel blade (#15) and holder (Becton Dickinson)
  • Bulldog clamps (Fine Science Tools)
  • Dental tool or bone scraper (Fine Science Tools)
  • Side grasping forceps Dumont #6 (Fine Science Tools)
  • 3mm outer diameter trephine (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania)
  • Solid nylon cord (1.7 mm diameter, e.g. weed trimmer line)
  • Super glue gel
  • Loctite cyanoacrylate glue (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation)
  • Jet Acrylic Liquid (Butler Schein)
  • Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein)
  • Storage Oscilloscope TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix)
  • Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • LFP device (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • High-pressure tubing, length 41cm, volume 2ml (Baxter)
  • 3M Vetbond Tissue Adhesive (Fisher)

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References

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Comments

12 Comments

  1. Hi,
    I do this same procedure but am frustrated with the glue I use. DŒs the Loctite keep the trephine guide in place and dŒs it help keep the hub from wobbling and scooting around when you apply the dental acrylic?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:18 PM
  2. The loctite glue dŒs work well to keep the weed whacker circle afixed and the trephine from slipping around. We do not use the loctite glue to keep the hub in place. For that we use super glue gel and you do have to have a steady hand to prevent the hub from moving while applying the glue. Wait a minute for the glue gel to dry before applying the dental cement.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:17 PM
  3. Hi again,
    I'd also like to ask if the IV line that you use to connect the animal to the FPI device has any affect on the level of injury, the wave form, or if you have to make any adjustments to compensate for the additional length of the line?
    Thanks again for your time.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:23 PM
  4. The tubing we purchase is a fixed length. We assume that different lengths may affect the waveform which could be adjusted empirically with test pulses.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:29 PM
  5. Hi,
    I would like to ask you where did you purchase the trephine you used for the craniotomy?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 6:37 AM
  6. We got ours from the Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:17 AM
  7. Hi, thank you very much for the quick response;
    However, when I read Research Instrumentation Shop, I tried to google it, but I see that they are a very specific shop for your university.
    I am trying to perform some craniotomies in my mice using a dental drill, however it seems that your way is more efficient and less risky. Is there another way to obtain such trephine? It's a very delicate instrument that is very difficult to find. Do you have perhaps other alternatives?

    Thank you very much and sorry for the trouble

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:31 AM
  8. I am sorry, but i know of now other source than U of P. They are custom made and are made to order. I have found then to make a very clean window without any danger of heat-induced damage. I have also used trephines attached to microdrills with much less success. I am have also made window using these trephines for ²-photon imaging of live mice.



    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:31 AM
  9. I used to get mine from U. of Penn also, but I was told they no longer wanted to make them. I switched to using a pin vise from a hardware store, coupled with a trephine from FST, item # 18004-²7. I feel this works better than the ones from U. Penn, the pin vise is slightly larger so I have more to hold on to and therefore more control. Pin vises are inexpensive but you will need to replace them frequently because they eventually rust; they are not made to be autoclaved. Alternately, you could get one or two of them plated in nickel, which would eliminate the need to replace them. We have a shop here that dŒs that kind of work, I discussed this with them when I was switching from the U.Penn trephine to the Fine Science Tools type.
    Custom Design & Fabrication South, LLC
    ²²90 Spain Drive
    Petersburg, VA ²3805-8403
    (804) ²01-5471
    Hope this is helpful to you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:32 AM
  10. Thank you very much for the info and the concern

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:43 AM
  11. Terry,

    That is a very useful idea--I have a FST trephine that I have not used yet. I will give it a try.

    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:45 AM
  12. Very nice demo! Just a minor comment about anesthesia. Mouse respiration rate should be around 60 times/minute even under 100% O² during the surgery in order to minimize artifact on animals. This video showed that the mouse receiving surgery exhibited a very slow respiration, 5 to 6 seconds a time, namely about 1² times/minute, which indicated that anesthesia in this demo was too deep. If the conc of isoflurane is maintained between 1.1 to 1.4%, during the surgery, you should not have that problem.

    Reply
    Posted by: YeQing P.
    February 17, 2013 - 10:11 AM

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