Percussion Fluide latéral: modèle de lésions cérébrales traumatiques chez la souris

Neuroscience
 

Summary

Fluide latérale percussions (LFP), un modèle établi de blessure traumatique du cerveau chez la souris, est démontrée. LFP répond à trois critères principaux pour les modèles animaux: la pertinence de validité, la fiabilité et la clinique. La procédure, composé de craniotomie chirurgicales, la fixation de la plaque tournante suivie par l'induction d'une blessure, résultant en des blessures focale et diffuse, est décrite.

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Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063, doi:10.3791/3063 (2011).

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Abstract

Une lésion cérébrale traumatique (LCT) de recherche a atteint l'élan renouvelé en raison de la prise de conscience croissante des blessures à la tête, ce qui résulte de la morbidité et la mortalité. Basé sur la nature de la blessure principale suivante TBI, résultat complexe et hétérogène des conséquences secondaires, qui sont suivis par 1,2 les processus régénératifs. Blessures primaires peut être induite par une contusion directe au cerveau à partir fracture du crâne ou de cisaillement et d'étirement du déplacement des tissus du cerveau provoquant en raison du mouvement 3,4. Les hématomes résultant et des lacérations provoquer une réponse vasculaire 3,5, et les dommages morphologiques et fonctionnelles de la substance blanche conduit à des lésions axonales diffuses 6-8. D'autres changements secondaires fréquemment observées dans le cerveau sont l'œdème et l'augmentation de la pression intracrânienne 9. Après TBI il ya des altérations microscopiques dans les voies biochimiques et physiologiques impliquant la libération de neurotransmetteurs excitotoxique, médiateurs immunitaires et les radicaux d'oxygène 10-12, qui a finalement entraîner à long terme de troubles neurologiques 13,14. Ainsi en choisissant des modèles animaux appropriés de TBI qui présentent similaires événements cellulaires et moléculaires dans TBI humains et de rongeurs est essentielle pour l'étude des mécanismes sous-jacents des blessures et de réparation.

Différents modèles expérimentaux de TCC ont été développés pour reproduire les aspects de la TCC observés chez les humains, parmi eux trois modèles spécifiques sont largement adaptées pour les rongeurs: la percussion des fluides, l'impact et le poids corticale goutte / effets d'accélération 1. Le dispositif de percussion fluide produit une blessure par une craniectomie en appliquant une impulsion brève pression sur fluides à l'intactes mère. L'impulsion est créé par un pendule frappant le piston d'un réservoir de fluide. La percussion provoque un déplacement du bref et la déformation du tissu neural 1,15. A l'inverse, l'impact des blessures corticales fournit de l'énergie mécanique à la durée intacts via un pendule rigide sous pression pneumatique 16,17. La masse de chute / l'impact du modèle est caractérisé par la chute d'une tige avec une masse spécifique sur le crâne fermé 18. Parmi les modèles TBI, LFP est le modèle le plus établi et couramment utilisés pour évaluer les lésions cérébrales mixtes focale et diffuse 19. Il est reproductible et est standardisé pour permettre la manipulation des paramètres de blessure. Récapitule LFP lésions observées chez les humains, la rendant ainsi cliniquement pertinentes, et permet l'exploration de nouveaux traitements pour la traduction clinique de 20.

Nous décrivons le protocole détaillé pour effectuer la procédure LFP chez la souris. La blessure infligée est légère à modérée, avec des régions du cerveau comme le cortex, l'hippocampe et le corps calleux étant les plus vulnérables. Hippocampique et le moteur des tâches d'apprentissage sont explorés suivantes LFP.

Protocol

1. Craniectomie

  1. Un site chirurgical stérile est préparé, y compris un instrument d'alignement stéréotaxique (Kopf Instruments) pour les souris avec un support de la souris gaz de tête anesthésie (Kopf Instruments) relié à un appareil d'anesthésie avec O 2 flush (Parkland scientifique) afin de permettre l'inhalation continue de l'isoflurane pendant la chirurgie . Un pad réchauffement maintenue à 37 ° C est placé sous la souris pendant la chirurgie. Un microscope chirurgical et source de lumière est nécessaire. L'expérimentateur doit porter une blouse, un masque chirurgical, couvrant le pied, des gants et couvre-chef. Tous les outils et matériaux que le contact du site opératoire doivent être stérilisés.
  2. Un concentrateur blessure, composé de l'extrémité femelle d'un Luer-Lok, est créé en coupant le bout de métal d'un 20 g 1 ½ "aiguille (Becton Dickinson) avec une lame de rasoir. Le moyeu doit être coupé avec un léger biais et de avoir une ouverture de diamètre d'environ 3mm intérieure. Le trépan (voir l'étape 1.10) peut être utilisé pour mesurer et fabriquer une plaque tournante des blessures du diamètre correct. Un hub est nécessaire par animal. Le hub sera fixé au crâne et relié à la LFP appareil pour qu'il délivre le pouls de la pression.
  3. Corde de nylon solide (1,7 mm de diamètre, par exemple, la ligne débroussailleuse) est coupé en ~ 1 mm d'épaisseur des disques en utilisant une lame de rasoir. Encore une fois, un disque est nécessaire par animal. Ceci est utilisé pour stabiliser le trépan dans l'exercice de la craniectomie (voir l'étape 1.10).
  4. Les souris peuvent être de toute souche et l'âge (nous utilisons principalement des C57BL / 6 âgés de 1 - 9 mois). La souris est pesé et anesthésiés dans une chambre d'induction de petite taille (pré-rempli avec 4-5% d'isoflurane dans 100% d'O 2) pour au moins 1 minute. Pour l'analgésie préventive, une injection de buprenorphrine (0,1 mg / kg) est administrée par voie intrapéritonéale et de la souris est placée de nouveau dans la chambre pour une autre minute. Traitement antalgique doit être confirmé par une consultation avec l'utilisation d'animaux locaux et le comité de soins.
  5. Les cheveux sur le dessus de la tête de la souris est paré au plus près à la peau que possible. La souris est positionné dans un instrument d'alignement stéréotaxique équipé mordent plaqué conçu pour administrer une anesthésie de gaz volatils (Kopf Instruments). Le niveau du gaz isoflurane est réduit à 2% ou à effet. Le rythme respiratoire est contrôlé visuellement pendant la chirurgie. D'autres paramètres physiologiques tels que les gaz du sang (p O 2, p CO 2), le pH du sang ou la tension artérielle peut être mesurée en utilisant un équipement approprié lors de la procédure.
  6. Artificial onguent larmes des yeux lubrifiant est mis sur les yeux de la souris en utilisant un applicateur de coton pour les empêcher de sécher. Povidone-iode est appliqué sur la peau entre les yeux et le cou avec un coton suivie par 70% d'alcool. L'application de povidone-iode et d'alcool est répétée pour un total de 3 fois.
  7. Une incision du cuir chevelu médiane est faite à partir des yeux à la nuque à l'aide d'un scalpel (lame n ° 15) et la peau rétracté avec un bulldog petits colliers (Outils Fine Science # 18050-28) pour exposer le crâne et de fournir un champ libre chirurgicale. Les pinces bulldog pendent les bords latéraux du crâne.
  8. Anesthésique topique bupivacaïne (0,025% dans une solution saline) est appliqué sur le crâne avec un applicateur en coton et le fascia est raclé du crâne avec la pointe d'outil dentaire ou d'un grattoir d'os (par exemple, outils Fine Science, # 10075-16).
  9. Un marqueur permanent est utilisé pour marquer le crâne mi-chemin entre bregma et lambda, et entre la suture sagittale et arête latérale plus l'hémisphère droit (~ 2 mm à droite de la ligne médiane). Une goutte de colle cyanoacrylate Loctite (Loctite Tak Pak 454) est mis dans un sac plastique pèsent pince bateau et secondaires de préhension (Outils Fine Science, Dumont # 6) sont utilisés pour tremper un disque de corde de nylon solide mauvaises herbes (voir 1.3 ci-dessus) dans le la colle et appuyez ensuite sur le disque sur la marque sur le crâne. Une à deux gouttes de l'accélérateur de Loctite est livré sur le dessus du disque à l'aide d'une seringue de 1ml et 26 3 / 8 G aiguilles pour provoquer le durcissement de la colle. Test de l'adhérence du disque sur le crâne avant de procéder.
  10. Placez un 3 mm de diamètre extérieur trépan (Boutique instrumentation pour la recherche, Université de Pennsylvanie) sur le disque et de spin dans le sens horaire jusqu'à ce que vous avez passé à travers le crâne. Vérifiez le progrès le trépan fréquemment pour éviter de percer trop loin dans le crâne et la rupture de la dure-mère. Il y aura un amincissement du crâne autour du périmètre du disque et le volet du crâne se sentent perdre lorsqu'il est pressé à la légère. Placez l'outil dentaires parallèle / horizontale à la surface du crâne pour faire levier sous le crâne et soulever le volet osseux en place. Détachez l'os du crâne avec une pince. S'il ya une petite quantité de sang, sans compromis de la dure-mère, utiliser un applicateur en coton pour appliquer une pression jusqu'à ce que le saignement s'arrête et empêcher la poussière d'os de pénétrer dans la dure mère. Cependant, si il ya une brèche dans la durée telle que hernie est visible, l'animal devrait être éliminé de l'expérience par euthanasie. Cette étape nécessite une pratique suffisantepour atteindre les compétences chirurgicales nécessaires.
  11. En utilisant des pinces, de maintenir la plaque tournante des blessures en position sur la craniectomie dans le crâne afin que le biais du moyeu est aligné avec la courbure du crâne (le plus long bord de la plate-forme se trouve près de l'arête latérale du crâne). En attendant, l'aide d'un bâton de bois, coupé à un angle avec une lame de rasoir pour avoir un bout pointu, appliquer le gel super glue sur les bords extérieurs du moyeu avec la main opposée et stabiliser le hub jusqu'à ce qu'il soit apposé debout sur le trou. Des précautions doivent être prises pour ne pas mettre de colle sur le dessus de la dure-mère. Glue sur la durée va provoquer une atténuation de la blessure.
  12. L'utilisation d'un gobelet en papier, mélanger méthacrylate de méthyle acrylique dentaire (liquide Jet acrylique avec Perm Reline / réparation de résine, Butler Schein) pour créer une solution visqueuse. Utiliser une seringue de 1 cc sans aiguille attachée à appliquer le ciment tout autour du carrefour des blessures. Le ciment devrait couvrir le fond 2 mm de la plaque tournante des blessures ainsi que le crâne entourant exposés. Les sutures crâniennes sont scellés avec du ciment pour s'assurer que le bol de liquide de la blessure reste dans la cavité crânienne.
  13. Remplir le moyeu avec NaCl 0,9% stérile (sérum physiologique) en utilisant une seringue et une aiguille émoussée. Les salines se conserver l'humidité dura pendant la phase de récupération. En outre, si la plaque tournante des blessures ne reste pas rempli, qui indique une fuite dans le moyeu au crâne et un nouveau pôle doit être jointe. La souris devrait être donnée d'une injection de 0,25 ml de solution saline stérile IP, retiré de l'alignement de l'instrument stéréotaxique et placé dans une cage vide sans couvercle barre de fil sur une plaque chauffante. Placez quelques HydraGel sur le fond de la cage et permettre à la souris pour récupérer pendant 1-2 heures.

2. L'induction de lésions

  1. Mettez l'oscilloscope (Tektronix TDS 1001B, deux Oscilloscope canal de stockage pièce de 40 MHz, 500Ms.s) et amplificateur (inducteur Trauma Capteur de pression amplificateur) qui est connecté à l'appareil LFP. Confirmez que le périphérique LFP (conception et la fabrication, la Virginia Commonwealth University) et le tuyau à haute pression (longueur 41cm, le volume de 2ml, Baxter # 2C5643) qui y sont connectés sont remplis d'eau stérile et exempt de bulles d'air. A la fin de la tubulure est un mâle Luer-Lok pièce. Avec la fin Luer-Lok du tube fermé, délivrer des impulsions de test en libérant le pendule. Le dispositif devrait être amorcée en fournissant environ 10 impulsions de test. Confirmer que le pendule donne le signal en douceur sur l'oscilloscope et l'amplificateur. Un signal bruyant indique air dans le système qui doit être enlevé avant la livraison de l'impulsion de blessure. La durée de l'impulsion doit être d'environ 20 ms. L'amplificateur de sonde fourni avec l'appareil est calibré LFP tels que 10 mV = 1,0 livres par pouce carré (PSI). Une atmosphère (ATM) = 14,7 PSI. Pressions blessures livrés sont typiquement dans la gamme de 0,9 à 2,1 atmosphères de produire une gamme de redressement fois réflexe et une augmentation de la mortalité associée à un œdème pulmonaire. Légère blessure est considérée comme un temps de réflexe de 2 - 4 min et un 0 - taux de mortalité de 5%. Blessures modérée est considérée comme un temps de réflexe de redressement de 6 - 10 min et 10 - taux de mortalité de 20%. Si nécessaire, ajuster l'angle du pendule pour augmenter ou diminuer l'intensité de l'impulsion. L'angle de position de départ du pendule est d'environ 10 degrés. Après réglage du dispositif LFP, assurez-vous d'ouvrir la fin Luer-Lok de la tubulure.
  2. La souris est placée dans la chambre de l'anesthésie 4-5% d'isoflurane (pré-chargés) jusqu'à ce qu'un plan chirurgical d'anesthésie est atteint. La souris est placée sur une plate-forme à côté du périphérique LFP et le moyeu est rempli de solution saline stérile. Le tube de l'appareil LFP avec un mâle Luer-Lok est attaché à la femelle Luer-Lok montage du moyeu. L'animal est placé sur le côté et une fois la normale reprend modèle de respiration, mais avant que l'animal reprendre conscience complète (~ 2 min), le pendule de l'appareil LFP est libéré pour provoquer une impulsion unique de blessure. Il est important de ne pas induire la blessure alors que l'animal est trop anesthésiés car elle pourrait provoquer une défaillance respiratoire et la mort. La pression exacte de l'impulsion doit être enregistré. Indemne, les animaux subissent imposture tous les mêmes procédures, à l'exception de l'impulsion de fluide réel pour induire une blessure.
  3. L'animal doit être immédiatement retirée de l'appareil LFP et placé sur le dos pour surveiller le temps de réflexe. Après la souris s'est redressé, il est ensuite brièvement anesthésiés à nouveau et le ciment et le moyeu enlevé en même temps à partir du crâne à la main. Le cuir chevelu est ensuite fermée par du tissu adhésif Vetbond (3M), suture ou des agrafes. Toute hernie de la dure-mère ou d'occlusion du moyeu est noté. Un concentrateur occlus va produire une blessure atténué d'une ampleur inconnue. L'animal est replacé dans la cage sur un pad réchauffement jusqu'en ambulatoires et est ensuite retourné dans sa cage à la maison.

3. Évaluation de moteur, les résultats cognitifs et histologiques

  1. Le moTor déficits causés par LFP peut être déterminé en utilisant le test de la tige tournante, un indicateur de vestibulomotor intégré et la fonction sensori-21. Tous les animaux doivent être testés avant l'accident pour déterminer une lecture de base et pour acclimater la souris au paradigme. Les souris sont formés sur le dispositif rotarod 3 fois par jour avec une heure d'intervalle intertrial pour les deux jours avant la blessure. Le temps de latence à l'équilibre sur un diamètre de 36 mm extérieur, en rotation la tige, qui a une surface en caoutchouc est mesurée. La vitesse passe de 4 à 40 tours par minute sur un intervalle de 180 sec. Chaque essai se termine lorsque l'animal tombe du rotarod.
  2. A différents moments après la blessure (typiquement de 1, 7 et 21 jours), les souris sont à nouveau testées sur le dispositif rotarod. Evaluation des tests rotarod après la blessure est basé sur les scores individuels par rapport à leur temps de latence de base 22. La latence moyenne de la chute des souris blessées est comparé à celui des souris imposture.
  3. LFP cognitive fonction suivante peut être testée sur un ensemble distinct de souris en utilisant la piscine de Morris (MWM), une mesure sensible de la mémoire post-traumatique apprentissage et de travail spatiale chez les rongeurs 23. Les souris sont acclimatées au paradigme et testées pour répondre de base en utilisant un test plateforme visibles 4 jours avant l'accident. Un bassin circulaire blanc (1 m de diamètre) est rempli d'eau et non toxique de peinture blanche. La plateforme est visible en utilisant un drapeau ou un marqueur et sans repères visuels sont sur les murs. Plus de 4 essais, la souris est placée dans le quadrant opposé à celui de la plate-forme visible, et la latence de trouver la plate-forme est mesurée. Temps d'essai maximale est de 60 secondes et la souris reste ou est placée sur la plate-forme pendant 15 sec à la fin de chaque essai. L'intervalle est de 5 min intertrial au cours de laquelle la souris est réchauffé sur un coussin chauffant. La plate-forme est déplacée à un quadrant différent pour chaque procès et quatre essais sont effectués.
  4. Pour évaluer l'apprentissage, les souris sont formés sur le MWM en utilisant une plateforme cachée fixée dans l'un des quatre quadrants à divers moments après la blessure (typiquement de 1, 7 et 21 jours). Indices en noir et blanc sont placés sur les murs. Le quadrant dans lequel la souris est placé est pseudo-aléatoire varié tout au long de la formation et de temps à localiser la plateforme est enregistrée. Temps d'essai maximale est de 60 secondes et la souris reste ou est placée sur la plate-forme pendant 15 sec et réchauffé pendant 5 min entre les essais. Les souris sont soumises à des essais 8 / jour pendant 3 jours consécutifs. Pour évaluer la rétention de la mémoire, les animaux sont soumis à un essai de 60 sondes sec le lendemain du dernier entraînement. Pendant le procès, la sonde, la plate-forme est enlevée pour déterminer le temps passé et nagé la distance dans le quadrant où la plateforme utilisée pour l'être. Enfin, un test de la plate-forme visible est fait pour exclure du moteur possible et que les déficits visuels développés post-traumatique.
  5. Afin de déterminer les conséquences histologiques de lésion LFP, le tissu est fixé par perfusion intracardiaque dans NaCl 0,9% suivi par 4% de paraformaldéhyde à des temps désiré après une blessure. Tissu est post nuit à 4 ° C, puis cryoprotégés dans 10% et 30% d'une solution de saccharose et d'intégration. Frozen coupes sériées sont coupés sur un cryostat et traitées en utilisant diverses techniques immuohistochemical et histologiques.

4. Les résultats représentatifs:

La blessure provoquée par le dispositif LFP est reproductible de l'animal à animal, en particulier avec la formation chirurgicale suffisante. Pour maintenir la cohérence de la blessure, la quantité de pression livré à la mère par l'appareil est contrôlé. Le pendule frappe un cylindre rempli d'eau en acrylique à haute pression et les tubes de raccord Luer-Lok qui est connecté au hub blessures apposée sur le site craniectomie sur l'animal (figure 1A). Pour une blessure légère à modérée, l'angle du pendule est fixé à générer une pression allant de 0,9 à 2,1 atm et un oscilloscope connecté à un amplificateur est utilisé pour visualiser l'impulsion de pression (figure 1B). Blessure produit une gamme de redressement fois réflexe et une augmentation de la mortalité associée à un œdème pulmonaire. Légère blessure est considérée comme un temps de réflexe de 2 - 4 min et un 0 - taux de mortalité de 5%. Blessures modérée est considérée comme un temps de réflexe de redressement de 6 - 10 min et 10 - taux de mortalité de 20%. Par ailleurs, les souris soumises à LFP peuvent présenter posture tonique qui peut être le signe de la saisie. La saisie est souvent associée à un compromis mère. Ensemble, ces résultats suggèrent que la blessure est à l'origine des dommages neurologiques. Sham animaux sont connectés à l'appareil LFP, mais le pendule n'est pas libéré.

Pour visualiser les dommages induits par la LFP, nous avons effectué immunocytochimie en utilisant des anticorps qui reconnaissent les astrocytes et les macrophages qui sont tous deux types de cellules associée à une réponse à une blessure. Protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) révèle gliose coloration accrue dans le cortex de la région de blessure WHEREA souris imposture ne s'affichent pas astrocytose augmenté dans le site équivalent en dessous de la craniectomie (figure 2A, B). De même, MAC1 coloration démontre plus macrophages entourant le site de la lésion par rapport à des souris soumises à une intervention chirurgicale fictive. De plus, il ya des dommages physiques à la Foire tissu cortical visibles chez les souris soumises à LFP, mais pas dans simulacre souris (figure 2C, D).

Tests comportementaux suivants LFP doux peut être utilisé pour évaluer les résultats cognitifs et moteurs. MWM est utilisé pour déterminer les effets sur l'apprentissage et la mémoire. Utiliser des indices visuels dans la salle de test, les souris imposture devient rapidement plus efficace à localiser la plateforme avec chaque jour qui suit la formation dans le labyrinthe d'eau. Souris soumises à une légère LFP prendre plus de temps à localiser la plateforme cachée sur les deux premiers jours d'essais par rapport aux souris imposture mais semblent apprendre la tâche dès le troisième jour (figure 3A). Ces résultats suggèrent que la blessure réduit la vitesse à laquelle les souris peuvent acquérir l'apprentissage spatial. Pour déterminer l'effet des blessures sur la rétention de la mémoire, un essai de sonde est effectué un jour après la dernière séance d'entraînement. Souris Sham passer plus de temps dans le quadrant cible par rapport à des souris soumises à LFP doux ce qui suggère que la blessure a affecté la capacité des souris à rappeler l'emplacement d'où la plateforme utilisée pour résident (figure 3B). Afin d'évaluer la fonction locomotrice, les souris sont testées sur le dispositif rotarod. Souris soumises à une légère ont LFP courte latence moyenne à tomber par rapport à la souris imposture à 1, 7 et 21 jours après la blessure (ppp) (figure 3C). Ces données suggèrent que des souris blessées ont entravé vestibulomotor intégré et la fonction sensori-motrices.

Figure 1
Figure 1. Dispositif de la LFP et une trace représentant de l'oscilloscope obtenus lors de blessures. A) Les composants du dispositif LFP sont: le pendule fixé à un support et fixé à un angle prédéterminé pour fournir la force désirée, une eau remplie cylindre en acrylique avec des tubes à haute pression et un mâle Luer-Lok montage ci-joint, un amplificateur, et un oscilloscope. Représentant traces B) de l'impulsion de la pression de l'oscilloscope. La valeur crête à crête est de 2,16 volts indiquant une pression de 1,47 atm.

Figure 2
Figure 2. Gliose améliorée et une réponse inflammatoire suivantes LFP démontre l'étendue de la lésion. Frozen sections transversales (20μm) à travers le cerveau d'une souris soumis à une chirurgie imposture (A, C) ou une blessure LFP (B, D) 7 jours après la blessure (ppp). Corticale des images sont prises à l'épicentre de la craniectomie. (A, B) des tissus est coloré avec un anticorps pour identifier les astrocytes. Fibrillaire gliale protéine acide (GFAP) antibody (MAB360, Chemicon, 1:400) révèle une augmentation du nombre des astrocytes dans le cortex de la souris soumises à des blessures LFP (flèches) par rapport à une intervention chirurgicale fictive. Anticorps secondaire est de chèvre anti-souris 594 (1:1000). (C. D) Tissu est coloré avec un anticorps pour identifier les macrophages. MAC1 anticorps (MAC1-alpha de la chaîne CD11b, BD Biosciences, 01:50) révèle plus macrophges et / ou la microglie activée autour du site de la lésion dans le cortex (flèches) par rapport à une intervention chirurgicale fictive. Anticorps secondaire est le rat de chèvre anti CY3 (1:50). Barre d'échelle = 200μm en A et B, 100 microns en C et D.

Figure 3
Figure 3. Tests comportementaux suivants LFP douce démontre déficits blessés par rapport à des souris imposture. A) des souris soumises à LFP douces prennent plus de temps pour apprendre la tâche de trouver la plate-forme dans le MWM que les souris imposture. Sham vs LFP (secondes ave ± SEM) 1 jour 34,21 ± 3,02 vs 38,64 ± 2,63; 2 jours 24,52 ± 2,84 vs 27,21 ± 2,11; 3 jours 22,47 ± 2,00 vs 22,08 ± 2,52 (1 ppp, n = 9 imposture, 10 LFP) . B) des souris soumises à LFP légers passent moins de temps dans le quadrant cible pendant le procès de sonde de 24 heures après le dernier entraînement dans le relatif MWM à des souris imposture (21 dpi, n = 10). C) des souris soumises à LFP doux tomber l'appareil rotarod plus tôt que les souris imposture (1, 7 et 21 ppp, n = 5 imposture, 8 LFP). Les barres d'erreur représentent SE.

Discussion

La méthode présentée ici LFP modèles de nombreux résultats neuropathalogical et comportementaux de légère à modérée lésions cérébrales traumatiques qui est pourquoi il est devenu un modèle animal largement utilisé de TBI. Il ya plusieurs étapes essentielles à considérer en vue d'accroître la validité et la fiabilité de cette technique. Par exemple, il est important que seuls les animaux dont l'intégrité de la durée n'a pas été compromise lors de la craniectomie être soumis à la LFP et utilisées dans l'étude. Par ailleurs, si la craniectomie est occluse par toute colle ou de ciment tels qu'une partie de la durée sous la craniectomie n'est pas exposée à la force de la pression du fluide, l'animal devrait être éliminé de l'étude. Enfin, si le temps réflexe de redressement ou de taux de mortalité n'est pas dans la fourchette souhaitée, l'animal ne doit pas être inclus dans l'étude. L'intensité de l'impulsion de pression peut être augmentée pour générer des blessures plus graves.

Comme le montre la figure 1, la configuration de l'appareil LFP est relativement simple et la reproductibilité de la gravité des blessures est maintenu par la surveillance des atmosphères de pression sur l'oscilloscope. La forme lisse de la courbe sur la trace de l'oscilloscope indique qu'il n'ya pas de bulles d'air dans le fluide qui pourrait interférer avec l'induction de la blessure LFP. Une impulsion de test devraient être livrées avant d'induire des blessures et si la trace oscilloscope ne présentent pas une courbe lisse, des bulles d'air doivent être supprimés. La durée de l'impulsion est d'environ 20 ms ce qui représente le temps d'induction mesurée dans les simulations de crash test. Blessures des impulsions plus courtes sont susceptibles de produire des blessures plus focale. Par conséquent, cette durée de modèles pouls humain TCC.

Les changements morphologiques et cellulaires suivantes LFP comprennent les dommages physiques aux tissus ainsi que nombre accru d'astrocytes et les macrophages comme l'a montré dans la figure 2. Il est bien établi que l'un des signes caractéristique de blessure est l'hyperplasie des astrocytes et la formation d'une cicatrice gliale. La cicatrice gliale a été montré pour avoir des effets bénéfiques et nuisibles 24. De même, les macrophages sont connus pour s'accumuler dans les différents tissus après une blessure lors de la phase où le processus de guérison commence 25. Ainsi, l'augmentation du nombre de GFAP et MAC1 cellules positives dans les échantillons de LFP par rapport aux contrôles imposture est révélatrice de l'induction de la blessure. L'absence d'expression de ces marqueurs cellulaires spécifiques dans les contrôles de simulacre indique que les manipulations chirurgicales seuls n'ont pas des conséquences négatives sur la santé des tissus du cerveau et que les changements dans l'expression des protéines sont spécifiques au paradigme des blessures.

Les conséquences comportementales de LFP douces illustre la figure 3 comprennent les déficits cognitifs et moteurs. Les résultats MWM indiquent que les souris LFP apprennent finalement la tâche, mais à un rythme plus lent que les souris imposture et qu'ils ne se rappellent pas la tâche aussi bien un jour après la formation. Ainsi, même les souris légèrement blessées sont moins efficaces que les souris au simulacre utilisant des indices externes au processus, consolider, et de stocker des informations spatiales, qui doivent être récupérés lors des essais ultérieurs. Autres hippocampique dépendant des tâches cognitives telles que la réaction de peur conditionnée ont été montré pour être altérée dans des souris soumises à LFP 26. Enfin, le plus court temps de latence à tomber par des souris LFP par rapport aux souris imposture dans le paradigme rotarod jusqu'à 3 semaines après une lésion bénigne est un indicateur de déficits dans vestibulomotor intégré et la fonction sensori-motrices. Une blessure plus modérée de révéler des changements plus frappant dans les fonctions cognitives et motrices comme cela a été démontré par d'autres groupes 27-30.

En somme, la LFP est un modèle valable pour TBI humaine parce qu'elle remplit plusieurs des critères attendus. LFP donne la validité de construit en ce sens qu'il recrée le processus étiologique qui induisent TCC chez les humains. Plus précisément, la grandeur de la force et le taux de mortalité est semblable à celle qui se produit dans les sports légers et modérés et les blessures liées voiture avec l'avertissement que les interventions de pré-chirurgicale des blessures sont uniques au modèle animal. LFP présente également la validité apparente de cette récapitule LFP nombreux anatomique, biochimique, les effets neuropathologiques et comportementaux observés dans TBI humaine. Il ya deux changements focale et diffuse détecté après la LFP et la latéralisation de l'impact permet de comparer les dommages morphologiques du côté ipsilatéral à la lésion à celle du côté controlatéral. Une mise en garde est que les effets cognitifs et moteurs peuvent être plus subtiles comme un résultat de blesser un seul hémisphère. Enfin, LFP expositions validité prédictive et la fiabilité de la technique LFP permet l'évaluation de diverses manipulations pharmacologiques et génétiques avant ou après l'induction de dommages 20. Variables physiologiques comme la pression sanguine, le pH du sang et du sanggaz devront être mesurés en présence et en absence d'un médicament de test pour déterminer le mécanisme d'action d'un agent thérapeutique. Toutefois, en raison de la nature complexe des conséquences primaires et secondaires du TCC, c'est une tâche difficile d'identifier une seule intervention qui peuvent atténuer tous les symptômes.

Un examen ultérieur de la technique de LFP peut être l'utilisation de micro-fluides percussions qui emploie un microprocesseur, un instrument à entraînement pneumatique pour éliminer le besoin pour l'étalonnage de la force délivrée par le pendule et d'éviter les variables opérationnelles telles que les bulles d'air dans le fluide 15 . Toutefois, l'approche standard de LFP a été prouvée par de nombreux chercheurs d'être une technique fiable et simple d'explorer les mécanismes moléculaires sous-tendant les dommages et la récupération après TBI qui conduira à de meilleures interventions et la thérapeutique.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail est financé par la Commission du New Jersey sur la recherche des lésions cérébrales.

Materials

  • Stereotaxic alignment instrument for mice (Kopf Instruments)
  • Mouse gas anesthesia head holder (Kopf Instruments)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Anesthesia machine with O2 flush (Parkland Scientific)
  • Buprenorphrine (Webster Animal Supply)
  • Refresh Lacri Lube eye ointment (Fisher)
  • Bupivacaine/Marcaine (Webster Animal Supply)
  • Povidone-iodine solution (Fisher)
  • 20 g 1 ½” needles (Becton Dickinson)
  • Scalpel blade (#15) and holder (Becton Dickinson)
  • Bulldog clamps (Fine Science Tools)
  • Dental tool or bone scraper (Fine Science Tools)
  • Side grasping forceps Dumont #6 (Fine Science Tools)
  • 3mm outer diameter trephine (Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania)
  • Solid nylon cord (1.7 mm diameter, e.g. weed trimmer line)
  • Super glue gel
  • Loctite cyanoacrylate glue (Loctite 444 Tak Pak) (Henkel Corporation)
  • Jet Acrylic Liquid (Butler Schein)
  • Perm Reline/Repair Resin (Butler Schein)
  • Storage Oscilloscope TDS 1001B, 40 mHz, 500MS/s (Tektronix)
  • Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • LFP device (Custom Design and Fabrication, Virginia Commonwealth University)
  • High-pressure tubing, length 41cm, volume 2ml (Baxter)
  • 3M Vetbond Tissue Adhesive (Fisher)

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References

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Comments

12 Comments

  1. Hi,
    I do this same procedure but am frustrated with the glue I use. DŒs the Loctite keep the trephine guide in place and dŒs it help keep the hub from wobbling and scooting around when you apply the dental acrylic?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:18 PM
  2. The loctite glue dŒs work well to keep the weed whacker circle afixed and the trephine from slipping around. We do not use the loctite glue to keep the hub in place. For that we use super glue gel and you do have to have a steady hand to prevent the hub from moving while applying the glue. Wait a minute for the glue gel to dry before applying the dental cement.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:17 PM
  3. Hi again,
    I'd also like to ask if the IV line that you use to connect the animal to the FPI device has any affect on the level of injury, the wave form, or if you have to make any adjustments to compensate for the additional length of the line?
    Thanks again for your time.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 3:23 PM
  4. The tubing we purchase is a fixed length. We assume that different lengths may affect the waveform which could be adjusted empirically with test pulses.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 1, 2011 - 6:29 PM
  5. Hi,
    I would like to ask you where did you purchase the trephine you used for the craniotomy?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 6:37 AM
  6. We got ours from the Research Instrumentation Shop, University of Pennsylvania.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:17 AM
  7. Hi, thank you very much for the quick response;
    However, when I read Research Instrumentation Shop, I tried to google it, but I see that they are a very specific shop for your university.
    I am trying to perform some craniotomies in my mice using a dental drill, however it seems that your way is more efficient and less risky. Is there another way to obtain such trephine? It's a very delicate instrument that is very difficult to find. Do you have perhaps other alternatives?

    Thank you very much and sorry for the trouble

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 8:31 AM
  8. I am sorry, but i know of now other source than U of P. They are custom made and are made to order. I have found then to make a very clean window without any danger of heat-induced damage. I have also used trephines attached to microdrills with much less success. I am have also made window using these trephines for ²-photon imaging of live mice.



    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:31 AM
  9. I used to get mine from U. of Penn also, but I was told they no longer wanted to make them. I switched to using a pin vise from a hardware store, coupled with a trephine from FST, item # 18004-²7. I feel this works better than the ones from U. Penn, the pin vise is slightly larger so I have more to hold on to and therefore more control. Pin vises are inexpensive but you will need to replace them frequently because they eventually rust; they are not made to be autoclaved. Alternately, you could get one or two of them plated in nickel, which would eliminate the need to replace them. We have a shop here that dŒs that kind of work, I discussed this with them when I was switching from the U.Penn trephine to the Fine Science Tools type.
    Custom Design & Fabrication South, LLC
    ²²90 Spain Drive
    Petersburg, VA ²3805-8403
    (804) ²01-5471
    Hope this is helpful to you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:32 AM
  10. Thank you very much for the info and the concern

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 30, 2012 - 9:43 AM
  11. Terry,

    That is a very useful idea--I have a FST trephine that I have not used yet. I will give it a try.

    Reply
    Posted by: David C.
    January 30, 2012 - 9:45 AM
  12. Very nice demo! Just a minor comment about anesthesia. Mouse respiration rate should be around 60 times/minute even under 100% O² during the surgery in order to minimize artifact on animals. This video showed that the mouse receiving surgery exhibited a very slow respiration, 5 to 6 seconds a time, namely about 1² times/minute, which indicated that anesthesia in this demo was too deep. If the conc of isoflurane is maintained between 1.1 to 1.4%, during the surgery, you should not have that problem.

    Reply
    Posted by: YeQing P.
    February 17, 2013 - 10:11 AM

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