Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Bioengineering

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Summary

Monocamadas auto-organizadas (SAMs) formado a partir de tióis de cadeia longa alcano em ouro proporcionar bem-definida substratos para a formação de padrões de proteínas e confinamento celular. Microcontact impressão de hexadecanethiol usando um carimbo de polidimetilsiloxano (PDMS), seguido pelo preenchimento com um glicol terminada alcano tiol monômero produz um padrão onde proteínas e células absorvem apenas para a região carimbada hexadecanethiol.

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Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164, doi:10.3791/3164 (2011).

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Abstract

Impressão microcontact fornece um método rápido e altamente reprodutível para a criação de substratos bem definidos padronizada. Microcontact 1 Durante a impressão pode ser empregada para imprimir diretamente um grande número de moléculas, incluindo proteínas, DNA 2, 3 e silanos, 4 a formação de auto- monocamadas (SAMs) de tióis de cadeia longa alcano em ouro fornece uma maneira simples para confinar proteínas e células para padrões específicos contendo regiões adesivo e resistente. Esse confinamento pode ser usado para controlar a morfologia das células e é útil para examinar uma variedade de questões em proteínas e biologia celular. Aqui, descrevemos um método geral para a criação de padrões bem definidos de proteínas para estudos celulares 5 Esse processo envolve três etapas:. Produção de um mestre modelado usando fotolitografia, a criação de um selo de PDMS, e microcontact impressão de um ouro substrato revestido. Uma vez modelada, estes substratos de cultura de células são capazes de proteínas confinar e / ou células (pilhas ou linhas de células) para o padrão.

O uso de auto-montagem química monocamada permite o controle preciso sobre o padrão regiões proteína / células adesivas e não adesivas regiões, o que não pode ser conseguido usando stamping proteína direta. Hexadecanethiol, a longa cadeia de tiol alcano utilizado na etapa de impressão microcontact, produz uma superfície hidrofóbica que prontamente adsorve proteína de solução. O glicol terminada tiol, utilizado para preenchimento das regiões não-impressos do substrato, cria uma monocamada que é resistente a adsorção de proteínas e, portanto, de crescimento celular. 6 Estes monômeros tiol produzir monocamadas altamente estruturado que definir com precisão as regiões do substrato que pode suportar adsorção de proteínas eo crescimento celular. Como resultado, estes substratos são úteis para uma ampla variedade de aplicações, desde o estudo do comportamento intercelular 7 para a criação de microeletrônica. 8

Enquanto outros tipos de química monocamada têm sido utilizados para estudos de cultura de células, incluindo o trabalho do nosso grupo usando trichlorosilanes para criar padrões diretamente sobre substratos de vidro, 9 monocamadas padrão formado a partir de tióis alcano em ouro são straight-forward para se preparar. Além disso, os monômeros usados ​​para a preparação monocamada estão disponíveis comercialmente, estável, e não necessitam de armazenamento ou manipulação sob atmosfera inerte. Substratos padronizados preparados a partir de tióis alcano também pode ser reciclado e reutilizado várias vezes, mantendo confinamento na cela 10.

Protocol

1. Preparação do Mestre modelado (Figura 1)

  1. Centro de wafer de silício sobre o spin-aplicador e lave o wafer com acetona durante a etapa inicial do programa de rotação de dois ciclos na Tabela 1. A acetona evapora durante a segunda etapa do programa de spin deixando um wafer, limpo e seco.
  2. Aplicar cerca de 1 mL fotorresiste AZ9245 / in (em diâmetro) para a bolacha e spin-coat usando as condições descritas na Tabela 1.
  3. Soft-cozer a bolacha fotorresiste revestido a 110 ° C por 2 m usando uma placa de alta uniformidade.
  4. Photopattern o substrato utilizando um sistema de fotolitografia direto escrever ou um sistema de alinhador de máscara e uma máscara apropriada. Máscaras podem ser adquiridas a partir de um número de fontes comerciais. Além disso, transparências impressas com tinta absorvente UV, gravada para um apartamento óptica, pode ser usado para produzir padrões com características de grande porte.
  5. Desenvolver o wafer estampados em 1:2 desenvolvedor 400K: semi-condutores de água deionizada para a grade 1 m 45 s, com agitação suave. Lavar cuidadosamente com semi-condutores de água de grau deionizada e seque com uma corrente de azoto (N 2) de gás. Desenvolvimento padrão pode ser verificada com um microscópio com um filtro UV. Se o padrão não está totalmente desenvolvido, o wafer pode ser devolvido para a solução de desenvolvimento para o tempo adicional.

Nota: Para melhores resultados, photopatterning devem ser realizadas em um ambiente de sala limpa.

2. Preparação de PDMS Stamp (Figura 2)

  1. Preparar uma resina 10:01 por peso: mistura endurecedor de Sylgard 182 (PDMS) e cobrir completamente o mestre (wafer photopatterned) com a mistura em uma placa de Petri descartável.
  2. De-gás PDMS coberto mestre em um exsicador de vácuo até que não haja bolhas são visíveis e permitir que o selo para a cura em estufa a 65 ° C por 1,5 h. Antes de curar, é importante certificar-se o mestre está no fundo do prato, pois pode subir à superfície durante a etapa de desgaseificação.
  3. Corte o PDMS erradicar do mestre e ornamento para o tamanho apropriado. Armazenar o selo em um recipiente coberto (lado apresentam-se) para protegê-lo de poeira e detritos.

3. Preparação do substrato de ouro modelado (Figura 3)

  1. Prepare 25 milímetros no. 1 rodada lamínulas de vidro para a deposição de metal, tratando-as com plasma de oxigênio para 10 m. Enxágüe duas vezes com 18,2 de água deionizada mohms seguido por duas vezes com etanol, secagem com uma corrente de gás N 2 entre cada etapa.
  2. Usando um bolso multi-sistema de deposição por feixe de elétrons, depósito de 50 Å de titânio seguido por 150 de ouro Å. Não ventilação do evaporador entre deposição da camada de titânio e camada de ouro. Alternativamente, revestidas de ouro lamelas podem ser adquiridos a partir de uma variedade de fornecedores, no entanto, é importante que as camadas de metal são preparados por evaporação por feixe de elétrons e evaporação térmica não. Se comprado de uma fonte externa, substratos de ouro pode ser limpa por oxidação plasma ou "piranha" (7:3 Conc H 2 SO 4:. 30% H 2 O 2) 11 antes de usar.

Nota: "Piranha" solução é explosiva na presença de compostos orgânicos.

  1. Prepare a solução stamping, 10 hexadecanethiol mM em etanol absoluto ea solução de aterro, 1 mM glicol terminada tiol em etanol absoluto.
  2. Lavar o selo com etanol e seque bem com gás N 2. Aplicar solução para carimbar o selo gotas PDMS até totalmente revestido. Seque o selo cuidadosamente com gás N 2. Proceder a 5a e 5b conforme o caso com base nas características do selo PDMS.
    1. Pressione suavemente o selo sobre o substrato de ouro e permitir que a monocamada para formar por 15 s.
    2. Coloque o substrato de ouro em uma placa de Petri contendo 18,2 de água deionizada mohms, garantindo o substrato está submerso. Pressione suavemente o selo sobre o substrato de ouro e permitir que a monocamada para formar por 15 s.
  3. Lavar o substrato carimbada duas vezes com etanol, secagem com gás N 2 após cada lavagem e coloque o substrato em uma placa de Petri.
  4. Cobrir o substrato com solução de aterro e selar o prato com parafilme para evitar a evaporação.
  5. Permitir que a monocamada de fundo para formar no escuro por 12-14 h.
  6. Retirar as lamelas padronizada a partir da solução de enchimento e enxaguar duas vezes com etanol, secagem com gás N 2 após cada lavagem.

4. Aplicação de proteínas e células para o substrato Patterned

  1. Coloque a lamela estampados em uma pequena placa de Petri ou câmara de cultura de células e cobrir com 500 mL a 1 mL de fosfato de Dulbecco Buffered Saline (DPBS). O DPBS deve cobrir completamente o substrato durante a incubação de proteína para garantir uma cobertura de proteína.
  2. Adicionar uma solução concentrada de proteínas para o DPBS e misturar a solução por pipeting várias vezes. Incubar a mistura de proteína com o substrato a 37 ° C por 1 h. Concentrações finais de laminina e fibronectina são tipicamente 12 mcg / mL e 20 mcg / ml, respectivamente. Proteínas podem ser rotulados com um corante reativo de amina fluorescentes para permitir a visualização padrão fácil. No entanto, a proteína com a etiqueta deve ser misturado com proteína unlabeled 01:01 a rotulagem de proteínas pode interferir com a atividade biológica.
  3. Após a incubação, lavar abundantemente com o substrato DPBS (4-5x) para remover proteína desacoplado, tomando cuidado para não secar o substrato ou levá-lo através da interface ar-água. Após as três primeiras lavagens, adicionar aproximadamente 500 mL de meio de crescimento de células completo para manter um substrato molhado.
  4. Substituir o meio de crescimento usado para lavar o substrato com a mídia fresco.
  5. Dissociar e contagem de células para revestimento sobre o substrato. Ou células dissociadas primários, como os neurônios do hipocampo, ou linhagens de células imortalizadas, como células CHO-K1, pode ser utilizado.
  6. Células placa dissociado sobre o substrato. Tipicamente 30 a 200 células / mm 2 são utilizados.

5. Resultados representativos:

Figura 1
Figura 1. Esquemática gerais para a preparação de um mestre de fotolitografia padrão. Neste processo, uma bolacha de silício é limpa com acetona, revestidas com fotorresiste, expostos ao padrão de interesse, eo padrão é desenvolvido.

Figura 2
Figura 2. Gerais esquemático para PDMS preparação selo. Neste processo, o mestre padronizada é coberto com Sylgard (10:1 resina: endurecedor), de-gaseados num exsicador de vácuo, curada em estufa a 60 ° C e cortados.

Figura 3
Figura 3. Esquemática Geral de padronização substrato. Neste processo, substratos de vidro são revestidas com titânio (50A) e ouro (150A), utilizando um evaporador feixe de elétrons, modelado por hexadecanethiol microcontact impressão usando um carimbo de PDMS, backfilled com tióis glicol terminado alcano, e revestido com proteína fluorescente-rotulados.

Figura 4
Figura 4. Patterned master (A) e PDMS selo (B) preparado usando os métodos descritos. Barras de escala são 100μm.

Figura 5
SAMs Figura 5. Patterned visualizado com AlexaFluor 647-rotulados fibronectina (A) e CHO-K1 confinamento celular (B). Barras de escala são 100 mm.

Figura 6
Figura 6. Patterned laminina semeados com neurônios de rato E18 hipocampo menos 4 dias in vitro. AlexaFluor 350-conjugados de anticorpos anti-laminina é utilizado para a visualização padrão (A) e E18 neurônios do hipocampo do rato estão manchadas com MitoTracker Red 580 (B). Barras de escala são 100 mm.

Figura 7
Figura 7. Armadilhas potenciais no preparo do substrato padrão visualizado por AlexaFluor 647-conjugados fibronectina adsorção. (A) insuficiente leva a mistura irregular adsorção de proteínas. (B) aplicação irregular de pressão durante stamping leva à transferência parcial patten. (C) A pressão excessiva durante a estampagem pode levar ao colapso do selo. (D) de exposição da superfície padronizada para a interface ar-água durante a lavagem pode resultar em fundo adsorção de proteínas. Barras de escala são 100 mm.

Figura 8
Figura 8. Padronização submerso pode produzir padrões com características pequenas que são difíceis de impressão, impressão convencional microcontact no ar. Imagens (A) e (B) mostram diferentes regiões do mesmo padrão, impressas com o selo PDMS mesmo no ar (A) ou água deionizada (B). Linhas de 10μm de largura de apoio que cercam o padrão (adicionado para ajudar a evitar o colapso de selo) são vistos em (A), no entanto, as características menores dot como mostrado em (B) não são vistos. Isso demonstra que a impressão no ar funciona bem para os recursos maiores, mas a impressão em água pode ser necessário para os padrões com recursos menores. Barras de escala são 20 mM.

Ciclo Taxa de aceleração (rpm / s) Velocidade final (rpm) Tempo (s)
1 500 1000 5
2 3800 3800 30

Tabela 1.Dois ciclos do programa de rotação usado para criar uma camada grossa de 4,5 mM AZ9245 em um wafer de silício.

Para preparar selos PDMS para a formação de padrões substratos, um mestre em fotorresiste é o primeiro fabricadas (Figuras 1 e 4A). O mestre é o inverso do selo e é criado usando um sistema de litografia e gravação direta ou um alinhador de máscara. Quando um fotorresiste positivo, como AZ9245, é usado para a produção de mestre, o wafer resistir revestido é exposto à luz com o mesmo padrão que aparecerá sobre o substrato final. Embora nem sempre é possível, tem sido relatado que a proporção ideal (tamanho característica de resistir a espessura) para PDMS mestres selo é 1:2. 13 Descobrimos que proporções de 1:40 são possíveis, dependendo da natureza do padrão. AZ9245 wafers de silício revestido nas condições descritas aqui dar fotorresiste com uma espessura nominal de 4,5 mM. Nós descobrimos que essa espessura de AZ9245 pode ser usado para produzir mestres PDMS com recursos que variam de> 100 mm até 2 micra.

Selos PDMS são lançados a partir Sylgard 182 (ou Sylgard 184) usando o mestre fabricados a partir de fotorresiste (Figura 2). Mestres fotorresiste pode ser usado várias vezes para criar muitas cópias do mesmo selo. Após o endurecimento do PDMS, selos são removidos do mestre utilizando uma lâmina de barbear eo carimbo resultantes podem ser visualizadas em um microscópio, colocando recursos adicionais no selo para baixo sobre uma lamela de vidro (Figura 4B)

Adequada resultados stamping em uma afiada padrão de proteínas, claro que pode ser visualizado através da aplicação de proteína fluorescente etiquetado (Figuras 3 e 5). Alternativamente, imuno-histoquímica pode ser usado para visualizar o padrão de proteínas após a fixação das células (Figura 6). Crescimento celular é bem limitada ao padrão de proteínas para ambas as linhas de células imortalizadas e pilhas (Figuras 5 e 6).

Embora esta técnica é facilmente dominado, vários problemas comuns podem surgir. A aplicação da proteína sem mistura suficiente da solução de proteína concentrada no DPBS pode levar a padrões de proteínas desigual (Figura 7A). Stamping impróprio pode levar à transferência de padrões colapso parcial ou selo (Figura 7B-C). Além disso, expondo o substrato padronizado contendo proteínas adsorvidas ao ar podem prejudicar o monocamada causando diminuição da resistência no fundo (Figura 7D). Padrões composto de características muito pequenos (<5 mm) e alta razão de aspecto muitas vezes requerem o uso da impressão microcontact submersas. Neste procedimento de água (3.5b) é usado como uma barreira para evitar hexadecanethiol de depósito sobre o substrato fora do padrão (Figura 8). 14

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Discussion

Uma série de questões podem surgir na produção litográfica do mestre utilizado para PDMS criação de selo. Subexposição dos resultados resistir revestido wafer nos padrões nebulosas e indistintas e superexposição dos resultados resistir revestido wafer em recursos alargada ou faltando. Em geral, os mestres com tamanhos recurso de grande porte (> 10 mm) são relativamente fáceis de desenvolver padrões e, ao mesmo tempo mestres com recursos menores podem exigir extensa otimização de parâmetros photopatterning e desenvolvimento (além dos parâmetros recomendados pelo fabricante fotorresiste). Os mestres mais difícil produzir combinar as duas características grandes e pequenos.

Fabricação de um selo de PDMS de um mestre é simples utilizando o procedimento descrito na seção 2. No entanto, cuidados devem ser tomados para misturar completamente os dois componentes do Sylgard 182. Incapacidade de alcançar a mistura completa dos componentes vai resultar em uma incapacidade para endurecer o selo e destruição provável do mestre. Além disso, o comandante pode quebrar quando separando-o do selo PDMS se a força é usada em excesso ou torção ocorre durante a separação. Se o mestre faz pausa no processo de remoção do selo, ele ainda pode ser possível usar o selo após a limpeza com etanol. No entanto, este carimbo pode produzir padrões com sites defeito.

Durante a impressão microcontact de SAMs usando um selo PDMS é versátil e pode ser útil em muitas aplicações, uma série de passos cruciais devem ser seguidos para alcançar sucesso proteína e confinamento celular. Para obter boa proteína e confinamento celular, substratos de ouro deve ser preparado por deposição por feixe de elétrons, uma vez que a evaporação térmica leva a superfícies de ouro em bruto que não suportam a formação de monocamada adequada. Além disso, descobrimos que a forma como o substrato de vidro é preparado para a deposição de titânio e ouro também afeta a qualidade do substrato de ouro e estabilidade monocamada. Enquanto substratos de vidro pode ser limpa para deposição usando uma grande variedade de técnicas, incluindo de metanol em ebulição, "piranha", 11 e "urubu" solução de 12 em nossas mãos lamínulas preparados por oxidação de plasma são muito superiores aos lamínulas limpos usando outros métodos. Temos observado que os métodos de limpeza de ácido, solvente e base-base dar monocamadas com diminuição da estabilidade temporal e um maior número de sites de defeito.

A técnica de estamparia exata necessária para a produção de proteína ideal e os padrões de celular varia de acordo com o tamanho ea forma dos recursos a serem carimbados e relação de aspecto do carimbo. Normalmente, a técnica exata stamping para cada novo selo deve ser otimizada ea técnica de estamparia melhora depois de várias tentativas. Aplicando demasiada pressão durante stamping levará para carimbar colapso, o que está propenso a acontecer com selos contendo proporções maiores aspecto (Figura 7C). Alternativamente, a aplicação de resultados pouca pressão na transferência de padrão parcial (Figura 7B). Também é possível tirar vantagem da técnica de estamparia para alterar ligeiramente as características do padrão. Por exemplo, descobrimos que recursos podem ser ligeiramente aumentado de tamanho por estampagem por longos períodos de tempo e outros têm relatado que as dimensões de determinados recursos pode ser reduzido utilizando técnicas de impressão submersa microcontact. 15 bolhas de ar ficam presas Muitas vezes, sob o selo quando realização de estamparia submersa, no entanto, esta técnica pode dar os melhores resultados quando pequenos recursos em conjunto com grandes proporções são desejados.

Há muitas vantagens em usar a impressão microcontact em conjunto com auto-montagem química monocamada. Quando diretamente sobre substratos de impressão proteínas, mudanças conformacionais têm sido mostrados para ocorrer 16 atribuível à etapa onde as proteínas são secos durante o processo de estampagem. Esta etapa de secagem é pensado para levar a agregação de proteínas e desnaturação, que por sua vez afeta a função da proteína. No sistema SAM, proteínas adsorvem ao substrato de uma solução aquosa tamponada, idêntica a como substratos são geralmente preparadas para cultura de células. Além disso, a impressão microcontact de proteínas não conseguir confinamento celular por longos períodos de tempo, devido à falta de moléculas de proteína resistente fundo. 17 Em contraste, o uso de uma monocamada de fundo glicol prevê confinamento excelente. 5 Nos casos em que o uso de um substrato de ouro é ou não possível ou indesejáveis, monômeros triclorosilano pode ser utilizado em vez de permitir o confinamento de proteínas e células. 9 Embora existam métodos para o confinamento de proteínas e células que não dependem de impressão microcontact, estes métodos tendem a ser mais trabalhoso e não são passíveis de produzir grande número de substratos idênticos normalmente necessárias para estudos biológicos 18,19.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer ao grupo todo Maurer da Universidade de Washington, cujo conhecimento coletivo fez possível este protocolo. Financiamento para este trabalho é fornecido pelo Instituto Nacional de Saúde Mental (1R01MH085495).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer Wafer Reclaim Services 2 inch
Spin coater/hot plate Brewer Science, Inc. Cee 200CB Spin-Bake System
AZ9245 Photoresist Mays Chemical Company 105880034-1160
Direct-write photolithography system Microtech s.r.l. LW325 LaserWriter System
Mask Aligner HTG 3HR
AZ 400K Developer Mays Chemical Company 105880018-1160
Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
25 mm no. 1 round glass coverslips VWR international 16004-310
Plasma Oxidizer Diener Femto
Titanium piecesKamis Incorporated 99.95% pure
Gold pellets Kamis Incorporated 99.999% pure
Electron-beam evaporator Kurt J. Lesker PVD 75 Thin Film Deposition System with electron-beam accessory
Hexadecanethiol Alfa Aesar A11362
1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) Sigma-Aldrich 674508
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200 200 proof, absolute
Parafilm VWR international 52858-000
DPBS VWR international 4500-434 Without calcium and magnesium
Mouse Laminin I VWR international 95036-762
Human Plasma Fibronectin Invitrogen 33016-015
AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-20006
MitoTracker Red 580 Invitrogen M22425
AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-10168
Anti-laminin antibody Fisher Scientific AB2034MI

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References

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