Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

Biology
 

Summary

Hemos establecido un protocolo para la inducción de cardioblastos directa de pluripotentes células madre embrionarias humanas mantenidas en condiciones definidas con pequeñas moléculas, lo que permite la derivación de una gran cantidad de células progenitoras cardiacas humanas y funcionales cardiovasculares cardiomiocitos para su reparación.

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Parsons, X. H., Teng, Y. D., Parsons, J. F., Snyder, E. Y., Smotrich, D. B., Moore, D. A. Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction. J. Vis. Exp. (57), e3274, doi:10.3791/3274 (2011).

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Abstract

Hasta la fecha, la falta de una adecuada fuente de células humanas cardiaca ha sido el gran retroceso en la regeneración del miocardio humano, ya sea a base de células de trasplante cardíaco o por ingeniería de tejidos 1-3. Cardiomiocitos diferenciados convertido en terminales poco después del nacimiento y pierden su capacidad de proliferar. No hay evidencia de que células madre / progenitoras derivadas de otras fuentes, tales como la médula ósea o la sangre del cordón umbilical, son capaces de dar lugar a las células contráctiles del músculo del corazón después del trasplante de corazón en el 1-3. La necesidad de regenerar o reparar el daño del músculo cardiaco no se ha cumplido con la terapia con células madre adultas, ya sea endógeno o mediante la entrega de células 1-3. La genéticamente estable células madre embrionarias humanas (hESCs) tienen la capacidad de expansión ilimitada y sin restricciones de plasticidad, ofreciendo una reserva pluripotentes en derivación in vitro de grandes cantidades de células somáticas humanas que están restringidos al linaje en la necesidadde reparación y regeneración 4,5. Debido a la prevalencia de las enfermedades cardiovasculares en todo el mundo y la aguda escasez de órganos donados, hay un gran interés en las terapias de células madre basado en el desarrollo como un enfoque alternativo. Sin embargo, la forma de encauzar el potencial de diferenciación gama de hESCs pluripotentes de manera eficiente y previsible a un fenotipo deseado ha sido un gran reto tanto para el estudio del desarrollo y la traducción clínica. Los enfoques convencionales se basan en múltiples linajes de células pluripotentes inclinación a través de la diferenciación espontánea capa germinal, dando lugar a ineficiencia e incontrolable linaje compromiso de que a menudo es seguida por la heterogeneidad fenotípica y la inestabilidad, por lo tanto, un alto riesgo de carcinogénesis 6-8 (ver un esquema de fig. 1A). Además, sin definir los suplementos biológicos extranjeros / animal y / o alimentadores que han sido tradicionalmente utilizados para el aislamiento, la expansión y diferenciación de hESCs puede hacer uso directo de tales células especializaciónzed injertos en pacientes con problemas 9.11. Para superar estos obstáculos, hemos resuelto los elementos de un sistema de cultivo definido necesaria y suficiente para sostener el epiblasto pluripotence de hESCs, sirviendo como una plataforma para la derivación de novo de hESCs clínicamente adecuado y eficaz dirección de hESCs tal manera uniforme hacia linajes clínicamente relevantes por pequeñas moléculas 12 (ver un esquema de la figura. 1B). Después de la selección de una variedad de pequeñas moléculas y factores de crecimiento, se encontró que tales condiciones definidas prestados nicotinamida (NOAL), suficiente para inducir la especificación de cardiomesoderm directa de hESCs pluripotentes que más progresó a cardioblastos que generan cardiomiocitos humanos golpes con una alta eficiencia (Fig. 2 ). Hemos definido las condiciones para la inducción de cardioblastos directa de hESCs pluripotentes sin la intervención de múltiples etapas linaje cuerpo embrioides, lo que permite un buen control de derivación eficaz de ungran cantidad de células cardíacas humanas a través del espectro de las etapas del desarrollo de terapias basadas en células.

Protocol

1. Solución y preparación de los medios de comunicación

  1. Solución de revestimiento de gelatina: 0,1% (w / v) de gelatina en ddH2O, autoclave y se almacena a 4 º C.
  2. Matrigel recubrimiento soluciones. Solución de archivo: lento deshielo Matrigel (10 ml) a 4 ° C durante la noche, añadir 10 ml de helado de DMEM o DMEM/F12, mezclar bien y alícuota de 1 ml / tubo por debajo de campana esterilizada cultivo de tejidos, almacenar a -20 ° C. Solución de trabajo: descongelación lenta 1 ml alícuota Matrigel a 4 ° C durante 1-2 horas, la transferencia de 14 ml DMEM frío o DMEM/F12 y mezcle bien bajo campana de cultivo de tejidos esterilizados inmediatamente antes del revestimiento.
  3. Humanos laminina solución de recubrimiento: diluir 1 ml de solución humana laminina (0,5 mg / ml en Tris Buffered NaCl, almacenar a -80 ° C, descongelación lenta a 4 ° C durante 1-2 horas) con helado de DMEM o DMEM/F12 a 12,5 ml de solución de trabajo (40 pg / ml) bajo campana de cultivo de tejidos esterilizados inmediatamente antes del revestimiento.
  4. El crecimiento de las soluciones madre de los factores (500-1000X): disolver el factor de crecimiento de 10 mg/ Ml en tampón esterilizada (0,5% de BSA, 1,0 mM DTT, 10% de glicerol, 1XPBS) y almacenar desde 50 hasta 100 l / tubo de alícuotas a -80 ° C.
  5. Los medios de comunicación HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO reemplazo de suero (20%), L-alanil-L-gln o L-Gln (2 mM), MEM aminoácidos no esenciales (MNAA, 1X), y β-mercaptoetanol (100 M), se filtra y se almacena a 4 ° C, suplementado con 20 ng / ml de bFGF antes de su uso. O sustitución de "KO reemplazo de suero", con los componentes definidos: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-Gln (2 mM), MNAA (1X), MEM aminoácidos esenciales (MEAA , 1X), y β-mercaptoetanol (100 M), se filtra y se almacena a 4 ° C, complementados con bFGF (20 ng / ml), la insulina humana (20 mg / ml), ácido ascórbico (50 mg / ml), humanos activina A (50 ng / ml), la albúmina humana / Albumax (10 mg / ml), y la transferrina humano (8 mg / ml) antes de su uso.
  6. Los medios de comunicación HESC cardiaca diferenciación: DMEM/F12 (90%), FBS definido (10%), y L-alanil-L-Gln o L-gln (2 mM).
  7. Medios que contienen nicotinamida (NAM): añadir NMañana a los medios de comunicación o los medios de comunicación HESC HESC cardiaca diferenciación a la concentración final de 10 mM, se filtra, se almacena a 4 º C y utilizar dentro de 2 semanas de preparación.

2. Placa de recubrimiento

  1. Placas de capa con la gelatina: añadir 2,5 ml / pocillo de solución de gelatina al 6 placas e incubar durante la noche en un 37 ° C humidificado incubadora.
  2. Placas de capa con la laminina: chill recubiertos de gelatina y remover las placas de gelatina, añadir 2,5 ml / solución de revestimiento de laminina y Matrigel o humanos que trabajan para pre-enfriado gelatinizado placas de 6 pocillos y se incuba a 4 ° C durante la noche.

3. Pases y siembra hESCs indiferenciado bajo condiciones definidas

  1. Permita que las colonias de células madre crecen hasta 5-7 días de edad, y tener la placa de células madre a la cultura de microscopio de disección (pre-calentar la disección de la etapa a 37 ° C) por debajo de la disección de campana esterilizada.
  2. Seleccione colonias células madre se dividan. Morfológicamente, estas colonias deben tener> 75% hESCs indiferenciada (smtodas las células compactas), por lo general ligeramente opaca (no blanca amontonada células no, claro-las células diferenciadas), con borde definido bajo el microscopio de disección. Cuidado esquema de las colonias seleccionadas y eliminar la capa de fibroblastos diferenciados que rodea la colonia y todas las partes diferenciadas (si existe) de la colonia con el borde de la punta P2 pipeta o tirado capilares de vidrio.
  3. Retire el papel viejo que contenga flotante células diferenciadas separadas por aspiración. Lavar con los medios de comunicación células madre (sin bFGF) una vez. Añadir 3 ml / media células madre y fresco que contiene 20 ng / ml de bFGF.
  4. Cortar las colonias células madre indiferenciadas en trozos pequeños, y separar con la punta de pipeta estéril o un vaso tirado capilar.
  5. Piscina los medios de comunicación que contiene piezas sueltas de colonias en un tubo cónico de 50 ml. Lavar la placa una vez con 1 ml / medios de comunicación, así células madre que contiene 20 ng / ml de bFGF y la piscina juntos.
  6. Aspirar la solución de Matrigel o laminina humanos de las nuevas placas recubiertas. Alícuota de 4 ml / h, asíESC medios de comunicación que contiene piezas de colonia a una placa de 6 pocillos. Suavemente la placa de transferencia a la incubadora sin agitar y permitir que la colonia de semillas piezas durante la noche sin molestar a humidificado en una incubadora a 37 ° C con una atmósfera de 5% de CO 2.

4. Inducción cardíaca de hESCs el marco del Sistema de cultivo definido con Nicotinamida

  1. En el día 3 después de la siembra, eliminar la mayor parte de los antiguos medios de cada pocillo de la placa y dejar los medios de comunicación suficiente para permitir que las colonias de células madre que se sumerge (nunca permita que hESCs se seque). Reemplazar con 4 ml / media células madre y fresco que contiene 20 ng / ml de bFGF y 10 mM de nicotinamida (NOAL).
  2. Reemplazar los viejos medios con los medios de células madre fresco que contiene 20 ng / ml de bFGF y 10 mM NOAL cada dos días, y permitir cardiaca inducida por las colonias de células madre crecen hasta 80-10 días. Al exponer a los NOAL, todas las células dentro de la colonia va a sufrir cambios de la morfología de grandes células diferenciadas que se siguen multiplicando. Las colonias aumentarán de tamaño, y por 80-10 días, und células se empiezan a acumularse en algunas zonas de las colonias.

5. La diferenciación continua cardíaco en cultivo en suspensión

  1. Tome la placa de células madre a la cultura de microscopio de disección (pre-calentar la disección de la etapa a 37 ° C) por debajo de la disección de campana esterilizada. Cuidado esquema de las colonias y retirar la capa de fibroblastos que rodean la colonia (las células diferenciadas emigraron de la colonia) con el borde de la punta P2 pipeta estéril o se tira capilar de vidrio.
  2. Eliminar los viejos medios que contienen células de fibroblastos flotante desprendido por aspiración. Lavar con los medios de comunicación células madre (sin bFGF) una vez. Añadir 3 ml / medios de comunicación y nuevas células madre (sin bFGF).
  3. Cortar las colonias células madre cardiacas inducidas en trozos pequeños, y separar con la punta de pipeta estéril o un vaso tirado capilar.
  4. Piscina los medios de comunicación que contiene piezas sueltas de colonias en un tubo cónico de 50 ml. Lavar la placa una vez con 1 ml / medios de comunicación y células madre (sin bFGF) y la piscina juntos.
  5. Alícuota de 4 ml / y medio libre de suero células madre que contiene piezas de colonias en una placa de ultra bajo de 6 pocillos y se incuban en apego a 37 ° C humidificado incubadora para permitir la flotación grupos celulares (cardioblastos) para formar durante 4-5 días.

6. Vencer a la maduración de los cardiomiocitos en Cultura fenotipo adhesivo

  1. Piscina los medios de comunicación que contiene cardioblastos flotante en un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar a 1400 rpm durante 5 min. Aspirar los medios de comunicación antiguos como todo lo que pueda y agregue la misma cantidad de células madre a los medios de comunicación fresca diferenciación cardiaca que contiene 10 mM NAM.
  2. Pipeta de arriba a abajo para mezclar cardioblastos flotante y alícuota de 4 ml / pocillo para placas de 6 pocillos. La transferencia de las placas a un 37 ° C humidificado incubadora para permitir que cardioblastos adjuntar toda la noche.
  3. Vuelva a colocar los medios de comunicación células madre cardíacas diferenciación que contiene 10 mM NOAL cada dos días.
  4. En el día 8, reemplace con los medios de células madre sin diferenciación cardíaca NAM, y continúan reemplazando a HESC cardiaca diferenciación de los medios de comunicación eotro día. Cardiomiocitos golpes comenzarán a aparecer en alrededor de 1-2 semanas de cultivo continuo después de la retirada de los NOAL y el incremento en el número con el tiempo, y podría mantener las contracciones fuertes y rítmicas durante más de 3 meses.

7. Los resultados representativos:

Nicotinamida (NOAL) se vuelve suficiente para inducir hESCs mantiene en el sistema de cultivo definido para la transición de la pluripotencia exclusivamente a un fenotipo cardiomesodermal (Fig. 2B). Tras la exposición de hESCs indiferenciada a NAM, todas las células dentro de la colonia va a sufrir cambios de la morfología de grandes células diferenciadas que disminuye la expresión de Oct-4 y comienzan a expresar el factor de transcripción específicos cardíacos (CSX) Nkx2.5 y α actinina, de acuerdo con un fenotipo cardiomesoderm (Fig. 2B). Estas células diferenciadas que se multiplican y las colonias aumentan de tamaño. Aumento de la intensidad se Nkx2.5se observa generalmente en las áreas de las colonias, donde las células comienzan a acumularse (Fig. 2B). Después individual, la hESCs NAM-tratada se forma flotante grupos celulares (cardioblastos) en un cultivo en suspensión para continuar con el proceso de diferenciación cardiaca. Después de permitir la cardioblastos para fijar y seguir con el tratamiento de NOAL durante 1 semana, los cardiomiocitos golpes comenzarán a aparecer en alrededor de 1-2 semanas de cultivo continuo después de la retirada de los NOAL con un aumento drástico en la eficiencia, en comparación con espontánea multi-linaje diferenciación de hESCs sin tratamiento durante el mismo período (Fig. 2C). Las células dentro de los grupos golpes cardiomiocitos se expresan marcadores característicos de los cardiomiocitos, incluyendo Nkx2.5 y α-actinina (Fig. 2C). Las contracciones de los cardiomiocitos golpes fueron confirmados por los perfiles eléctricos a ser fuertes, rítmicos, bien coordinada y bien arrastrado, con impulsos regulares una reminiscencia de la p-QRS-T-complejos de vista de los electrodos de superficie corporal en los electrocardiogramas clínicos (Fig. 2C, también ver el video). Los cardiomiocitos podría conservar su contractilidad fuerte por más de 3 meses.

Figura 1
Figura 1. Planes generales del enfoque convencional frente a pequeñas moléculas de inducción de enfoque para la diferenciación de las células madre pluripotentes a células especializadas funcional. (A) Un esquema del enfoque convencional con múltiples linaje inclinación de las células madre pluripotentes a través de la diferenciación espontánea capa germinal. (B) Un esquema de un buen control de inducción eficiente de las células madre pluripotentes exclusivamente a un linaje particular clínicamente relevantes por la simple provisión de moléculas pequeñas.

Figura 2
Figura 2. Nicotinamida induce especificación linaje cardíaco directo de la pluripotencia bajo condiciones definidas y la progresión hacia la paliza cardiomiocitos. (A) Esquema que muestra de la línea de tiempo del protocolo de diferenciación dirigida cardiaca de hESCs. (B) Tras la exposición de hESCs indiferenciada a la nicotinamida (NOAL) bajo el sistema de cultivo definidos, gran diferencia octubre-4 (rojo), las células negativas dentro de la colonia comenzaron a surgir, en comparación con el modelo de tratado (DMSO) hESCs como control. NAM-inducida por las células octubre-4-negativos comenzaron a expresar Nkx2.5 (verde) y α-actinina (rojo), de acuerdo con la diferenciación cardíaca temprana. Aumento progresivo de la intensidad de Nkx2.5 se observó por lo general en las áreas de la colonia en donde las células empezaron a acumularse. Todas las células se indican con DAPI de sus núcleos (azul). (C) NAM-cardíaca inducida comprometidos hESCs cardiomiocitos dado golpes con un aumento drástico en la eficiencia, según la evaluación de los clusters celularestros que aparecen contracciones rítmicas (ver perfil electrofisiológicos y los videos), y immunopositive para Nkx2.5 (verde) y α-actinina (rojo). Imágenes de la fase de grupos representativos grandes golpes de cardiomiocitos y imágenes de mayor poder de representación de contratación músculos cardíacos se muestran (ver también videos correspondientes). Las flechas indican el grupo superando a cardiomiocitos de grandes dimensiones utilizados para el registro electrofisiológico. Perfil electrofisiológico de los cardiomiocitos superando los programas regulares, los impulsos incorporado, rítmica que recuerda a la p-QRS-T-complejos visto en los electrocardiogramas clínicos. Las barras de escala: 0,1 mm.

Videos: la contratación de los cardiomiocitos diferenciados de NAM-inducida hESCs. Videos 1 y 2 muestran gran representante de vídeo superando las agrupaciones de los cardiomiocitos en alrededor de 1 y 3 meses después de la unión. Vídeo 3 y 4 muestran representante de contracción de los músculos cardíacos con mayor potencia. 5 muestra una typical pequeño grupo de cardiomiocitos diferenciados de latir espontáneamente sin tratamiento hESCs MNOAL como control.

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Discussion

Uno de los mayores desafíos tanto para el estudio del desarrollo y la traducción clínica ha sido la forma de encauzar el potencial de diferenciación gama de pluripotentes células madre humanas a un fenotipo deseado de manera eficiente y predecible. A pesar de estas células pueden diferenciarse espontáneamente in vitro en células de todas las capas germinales por pasando por una etapa de agregado de varios linajes, en células madre de origen multi-linaje agregados (cuerpos embrioides), sólo una fracción muy pequeña de células (<2%) en forma espontánea diferenciarse en cardiomiocitos 13-15 (Fig. 1A). Inmunoselección siguientes, la población enriquecida de cardiomiocitos fueron capaces de funcionar como marcapasos biológicos para rescatar a la función de un miocardio dañado mecánicamente y electrónicamente después de la inyección en el corazón de los modelos animales 13. En modelos de roedores infartado, injertado células madre derivadas de progenies cardiaca fueron capaces de sobrevivir y madurar hasta 12 semanas, y en parte remuscularize el corazón herido y mejorar la función contráctil 14,15. Sin embargo, la ineficiencia en la generación de humanos cometidas células cardíacas a través de multi-linaje diferenciación de las células pluripotentes y el alto riesgo del trasplante de tumorigenicidad siguientes han dificultado la traducción de otro ensayo clínico. El desarrollo de estrategias para canalizar el potencial de diferenciación gama de hESCs pluripotentes exclusivamente y de manera predecible a un fenotipo cardíaco es vital para aprovechar el poder de la biología de células madre en el campo del corazón. A fin de lograr de manera uniforme la conversión de las células madre pluripotentes a un linaje particular, se empleó un sistema de cultivo definido capaz de asegurar la proliferación de hESCs indiferenciada para identificar las condiciones para un buen control de inducción eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente a un determinado linaje clínicamente relevantes por la simple provisión de pequeñas moléculas (Fig. 1B). Hemos encontrado que la nicotinamida cardíaca inducida por el compromiso de linaje directo de phESCs luripotent en la cultura que se define más avanzado para vencer a los cardiomiocitos de alta eficiencia (Fig. 2). Nkx2.5 es un factor de transcripción homeobox conservado evolutivamente indispensable para el desarrollo cardiaco normal y las mutaciones del gen están asociadas con las enfermedades humanas cardiopatías congénitas (CC), el defecto de nacimiento más comunes humanos 16. Expresión de Nkx2.5 es el marcador más precoz de las células precursoras del corazón en todos los vertebrados examinado hasta ahora, y es esencial para la tabicación cardíaca adecuada y la formación / maduración del sistema de conducción eléctrica 16. En los vertebrados, el inicio y el patrón de expresión a principios Nkx2.5 coinciden grosso modo con el tiempo y el área de especificación cardiaca en la embriogénesis temprana, y Nkx2.5 gen se sigue expresando a través del desarrollo en el corazón 16. En nuestro modelo de células madre, el MNOAL pareció provocar la inducción cardiaca directa de hESCs pluripotentes mediante la promoción de la expresión de la cardíacos específicos transcripción Nkx2.5 factor en un proceso que podría emular a la especificación de cardiomesoderm del epiblasto pluripotente en cardiogénesis embriones humanos. Los estudios futuros se muestran las moléculas de control genético y epigenético en el desarrollo del corazón humano, como alternativa, lo que puede allanar el camino para pequeñas moléculas mediada por el control directo y la modulación de las células madre pluripotentes destino al derivar linajes clínicamente relevantes para las terapias regenerativas. Sin tratamiento NAM, hESCs <2% se someterá a la diferenciación espontánea a vencer a los cardiomiocitos 12-15. Con el tratamiento NAM, hemos sido capaces de generar> 95% de precursores embrionarias cardíaca y> 50% de los cardiomiocitos paliza de hESCs mantenido bajo una cultura de definir en un proceso que podría emular el desarrollo humano corazón embrionario 12. Recientemente, se conoce cardiaca genes que determinan el destino se han utilizado para transdiferenciarse fibroblastos de ratón en el post-natal cardiomiocitos golpes con una baja eficiencia de <0,5% 17, 18 </ Sup>. Sin embargo, la reprogramación de células somáticas han sido históricamente asociada con la expresión del gen anormal y la senescencia acelerada con la utilidad terapéutica deterioro 19-21. Finalmente, el protocolo se estableció aquí se limita a hESCs pluripotentes derivadas de la masa celular interna (ICM) o epiblasto del blastocisto 4,5 humana, no puede aplicarse a las células pluripotentes, incluyendo CES animal se originó, derivados de los CES a principios de mórula (de ocho células)-etapa 22 embriones y las células reprogramadas artificialmente 23.

Disclosures

Los autores declaran conflictos de intereses. XHP es el fundador de Xcelthera. XHP y EYS tienen propiedades intelectuales relacionadas con hESCs.

Acknowledgments

XHP ha sido apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH) subvenciones del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIHK01AG024496) y el Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NIHR21HD056530).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Matrigel BD Biosciences 356231 Growth factor reduced
Human laminin Sigma-Aldrich L6274
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
DMEM/F12 Invitrogen 10565042
DMEM Invitrogen 31053036
DMEM-KO Invitrogen 10829018
Knock-out serum replacement Invitrogen 10828028
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) Invitrogen 11140050
MEM amino acids solution(MEAA, 100X) Invitrogen 11130050
β-Mercapt–thanol Invitrogen 21985023
Albumax Invitrogen 11020021
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human transferrin Sigma-Aldrich T8158
Human bFGF PeproTech Inc AF-100-18B
Human insulin Invitrogen 12585014
Human activin A PeproTech Inc 120-14E
Defined FBS Hyclone SH30073-03
6-well ultralow attachment plate Corning 3471
6-well plate Corning 3516

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    I have not touch measles ,bvFTD Ag85B,Pax6,CD34,SGA,shRNA,
    HMGB²,CDK5 ,SOX², siRNA, mRNA!,

    I work with Dr. Bernard Roizman on HSV-1,Vaccine at U of Chicago , ²7 years ago! http://www.gene²gene.com TB in here http://www.gene²gene.com/P53.htm stem cells,breast cancer, Dr. Verma,you did it on ²00² http://www.gene²gene.com/Bdnf.htm ADHD/Autism

    ²00²,I left Biocarta to work at ITRI Research Institute at Taiwan,
    Early Oct My mother pass away at San Diego, End of Oct,
    I participated running exercise at ITRI, I fall down, I saw my
    mother, She told me " It is not the time for you to come here,
    go back!" I also saw my brother in law, two uncles, and
    grandma! Few days later, I was moved to major hospital at Taipei!
    One night, I waked up, and knell down against the window,
    my wife ask me "What you doing?" I told her , I saw Jesse!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2011 - 11:43 AM

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