La medición de flujos rápidos de calcio en los cardiomiocitos

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Summary

Se presenta un método para aislar rápida (microsegundos) eventos de calcio de los flujos más lentos en las células vivas mediante microscopía confocal de barrido láser. El método mide las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia de los indicadores de calcio por los escáneres de la línea de la grabación de varios cientos de píxeles en una celda. Análisis del histograma nos permite aislar las escalas de tiempo de los flujos de calcio diferentes.

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Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (57), e3505, doi:10.3791/3505 (2011).

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Abstract

Cardiomiocitos tienen múltiples flujos de Ca 2 + de duración variable que trabajan en conjunto para optimizar la función de 1,2. Los cambios en Ca 2 + actividad en respuesta a los agentes extracelular generalmente regulado por la fosfolipasa Cβ-Gα vía q localizada en la membrana plasmática que es estimulada por agentes tales como la acetilcolina 3,4. Recientemente, hemos encontrado que el plasma dominios de la proteína de membrana llamada caveolas 5,6 activado puede atrapar Gα q 7. Esta trampa tiene el efecto de la estabilización del estado de activación de q Gα y prolongado resulta en Ca 2 + en cardiomiocitos señales y otros tipos de células 8. Hemos descubierto el sorprendente resultado de la medición de las respuestas dinámicas de calcio en una escala rápida en los cardiomiocitos de vida. Brevemente, las células se cargan con un fluorescente de Ca 2 + indicador. En nuestros estudios, hemos utilizado Ca 2 + Verde (Invitrogen, enc.) que exhibe un aumento en la intensidad de emisión de fluorescencia tras la unión de los iones de calcio. La intensidad de la fluorescencia se registra para utilizar un modo de línea de exploración de un microscopio confocal de barrido láser. Este método permite la adquisición rápida de la evolución temporal de la intensidad de la fluorescencia en píxeles a lo largo de una línea seleccionada, la producción de varios cientos de huellas de tiempo en la escala de tiempo de microsegundos. Estas huellas muy rápido se transfieren a Excel y luego en Sigmaplot para el análisis, y se comparan con las huellas obtenidas por el ruido electrónico, colorante libre, y otros controles. Para analizar las respuestas de Ca 2 + de diferentes tasas de flujo, se realizó un análisis histograma que binned intensidades de los píxeles con el tiempo. Hurgar en la basura que nos permite agrupar a más de 500 huellas de los análisis y visualización de los resultados compilados espacial y temporalmente en una única parcela. Por lo tanto, la lentitud en Ca 2 + olas que son difíciles de discernir cuando los análisis se superponen debido a la colocación de diferentes picos y ruido, puede ser visto fácilmente enlos histogramas agrupada. Flujos muy rápidos en la escala de tiempo de la medición muestran una estrecha distribución de intensidades en los contenedores de muy poco tiempo, mientras que más de Ca 2 + ondas de mostrar los datos agrupada con una amplia distribución en contenedores de tiempo más largo. Estas distribuciones horarias diferentes nos permiten analizar el tiempo de los flujos de Ca 2 + en las células, y para determinar su impacto en diversos procesos celulares.

Protocol

1. Las células de carga con los indicadores de calcio

  1. Células de la placa de 35 mm con fondo de cristal platos MatTek (o cualquier otro fondo de cristal, ver cámaras).
  2. Si se usa capa miocitos primarios de las cámaras un día antes con 10μg/ml laminina. Placa cardiaca miocitos (aislado de los perros adultos, ratas recién nacidas, u otro organismo), en KB buffer (K-inversión de tampón de Tyrode 35 mmol / L de HEPES, 140 mmol / L de KCl, 8 mmol / L de KHCO3, 2 mmol / L de MgCl 2 y 0,4 mmol / L de KH 2 PO 4, pH 7,5) y el cambio poco a poco a la M199 suplementado con suero fetal bovino 15% y el 1% y el 0,5% streptamycin gentamicina y se incuba a 37 ° C en 5% CO 2.
  3. Se incuban las células con el calcio verde mañana (01.05 M, Molecular Probes) o cualquier otro indicador de calcio deseada durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. Cubra el plato con papel de aluminio para evitar photobleaching de la tintura.
  4. Se lavan las células tres veces con Leibovitz15 medio con EGTA 14 mm (si la realización de experimentos en los niveles bajos de calcio) o cualquier otro medio de visualización adecuado.
  5. Incubar durante 30-45 minutos en otro medio Leibovitz15 containing14mM EGTA.
  6. Si las pruebas de los efectos de los inhibidores (es decir, 10μM U73122 PLC inhibidor) que añadir durante la segunda incubación.

2. Microinyección de células

  1. Cardiomiocitos cultura en el fondo de cristal platos MatTek (o cámaras de visión) durante 24 horas.
  2. Cambiar el medio de fenol libre de Leibovitz-15 con 14 mM de EGTA (cardiomiocitos tienen que ser inyectados en el medio libre de calcio, otras células pueden ser inyectados en el calcio que contienen medio).
  3. Prepare una solución de microinyección - nuestros estudios utilizaron un péptido que elimina Gα q - interacciones caveolae. Tenga en cuenta que sólo una pequeña cantidad de volumen que se inyecta en la célula (~ fL) y por lo tanto las poblaciones razonablemente concentrada debe ser utilizado. Utilizamos 2 M de este péptido, CAV3-andamio, con DAPI en un medio libre de calcio. DAPI es un blue colorante que tiñe el núcleo y permite la identificación de las células que han sido microinyección. DAPI no interfiere con la fluorescencia de los indicadores de calcio muchos. La cantidad de DAPI es variable y se utilizan generalmente suficiente para visualizar el núcleo (0,5 y 2 M)
  4. Prepare una solución de control con DAPI - el trazador de tinta solo.
  5. Para microinyecciones utilizar agujas auto-tira o disponibles en el mercado. La práctica con la inyección de medio de contraste para determinar los parámetros adecuados de la aguja. Tomamos nota de que las diferentes células podrían requerir diferentes diámetros y presiones de la aguja de microinyección.
  6. Utilizar el sistema de microinyección automatizado, por ejemplo, un NI2 InjectMan con una bomba de FemtoJet de Eppendorf. Ajuste la presión de inyección P i a 90 hPa, y la compensación de la presión P C a 45 hPa. Establecer el t tiempo de inyección a 0,7 s. Reajustar los parámetros de la inyección que necesita.
  7. Realizan microinyecciones en un microscopio invertido (por ejemplo, Zeiss AxioveRT 200M), equipado con el objetivo a largo distancia de trabajo de contraste de fase (por ejemplo, la fase de aire 40 veces el objetivo 2).
  8. Inyectar mayor cantidad de células posible de una manera rápida. Examinar las células inyectadas mediante el contraste de fases para seleccionar las células viables.

3. Co-inmunofluorescencia estudios

  1. Lavar las células dos veces con PBS y fijar con el 3,7% de paraformaldehído durante 30 minutos. Si es necesario, las células pueden ser estimuladas antes de la fijación.
  2. Lavar las células fija tres veces con PBS y se incuban con NP40 0,2% en PBS durante 5 minutos.
  3. Bloquear con PBS que contenía 4% de suero de cabra (o suero adecuado) durante 1 hora.
  4. Se incuban las células con el anticuerpo primario con una dilución adecuada con suero de cabra al 1% en PBS durante 1 hora.
  5. Lavar las células tres veces durante 10 minutos con 150 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,6 seguido por la adición de marcado con fluorescencia secundaria de anticuerpos, tales como Alexa-Fluor-488 anti-conejo o Alexa-Fluor 647-anti-ratón anticuerpo secundario diluido a 1: 1000 1% de suero de cabra en PBS (tenga en cuenta que al probar dos proteínas diferentes los anticuerpos primarios debe plantearse en las diferentes especies y la secundaria tiene que estar en contra de las especies correspondientes).
  6. Se incuba a 37 ° C durante una hora, lavar tres veces con TBS.
  7. Ver las células en tampón TBS u otro medio de visualización adecuado.

4. Imágenes de calcio rápida

  1. El uso de láser microscopio confocal de barrido (por ejemplo Fluoview 1000 Olympus).
  2. Uso objetivo de alta apertura numérica.
  3. Establecer los parámetros de adquisición. Para la excitación de calcio nm verdes utilizan 488 y 515 de largo pasan filtros de emisión.
  4. Ajustar el tiempo de pixel - para la medición de calcio rápidamente se establece en 2 ms / pixel.
  5. Ajuste el zoom de la imagen para alcanzar un tamaño de píxel de 0,05 a 0,3 micras.
  6. Seleccione una línea de una célula de la elección en una región particular.
  7. En la ventana del controlador de selección de tiempo de adquisición en tiempo de por lo menos 1500 ciclos (cuando se requieran plazo dela respuesta - 1,3 ms / línea daría 2 segundos).
  8. Registro de antecedentes de lectura antes de la estimulación.
  9. Estimular las células con 5 carbacol M e iniciar inmediatamente el registro de datos. Mantener las células en 1 ml de medio Leibovitz15, preparar 10 carbacol M en Leibovitz15 y añadir con cuidado 1 ml en el plato

5. Análisis de datos

  1. Extracto de la intensidad de cada píxel de la imagen grabada. Guardar los datos de intensidad como una tabla utilizando Fluoview 1000 software.
  2. Importación de datos de intensidad en Sigmaplot o un programa de análisis de datos similares y la bandeja de los datos en ~ 90-40 contenedores. Compare con el control de los experimentos y el ruido electrónico.

6. Los resultados representativos:

Hemos fotografiado en las células láser confocal de barrido microscopio LSM510 (Zeiss, Jena, Alemania) equipado con una excitación láser de múltiples líneas y un 40x/1.2 apocromático NA objetivo de inmersión en agua. En la figura. 1 (roja) se muestra el distribution de caveolae en caninos ventricular cardiomiocitos adultos que han sido fijadas y teñidas con un anticuerpo para la caveolina-3, que es la principal proteína estructural caveolar en estos 9 celdas. Caveolina-3 se immunolabelled con Alexa-647 y entusiasmados con la línea de 633-nm de uno Él: Ne laser. Las imágenes fueron registradas con filtro LP650 nm de emisión. La distribución de la caveolina-3 se comparó con Gα q que se immunolabeled con Alexa-488 (verde). Alexa-488 se entusiasma con 488nm de iones de argón láser de línea y se grabó la imagen usando el filtro de emisión BP505-530nm. En estas mediciones colocalización, los dos fluoróforos se entusiasmaron de una manera secuencial con la adquisición de varias pistas. Este procedimiento minimiza el canal de cross-talk. Análisis de los datos de colocalización se realizó utilizando el software de AIM siempre con óptica Carl Zeiss LSM510-Meta. Como puede verse, las dos proteínas están colocalized.

Para determinar cómo el acoplamiento entre la caveolina-3 y Gα 2 + Verde. Estamos entusiasmados con el tinte 488 nm láser de iones de argón y recogieron las imágenes a través de un filtro de emisión LP515. Cuadros de imagen han sido recogidos en intervalos de 500 ms. Valores de intensidad para cada píxel se obtuvieron mediante el software Olympus y ImageJ. El modo de escaneo en línea fue utilizada para el análisis cuantitativo de más rápido Ca 2 + transitorios y Ca 2 + chispas. El tamaño de los píxeles utilizados en el presente estudio fue 0.1-0.3 micras. La velocidad de la línea de barrido fue de varios cientos de ms por línea. En la figura. 2 se muestra un análisis de la línea de Ca 2 + Green-cargado de cardiomiocitos en el píxel dtiempo y fue de 2 ms, el tiempo de la línea fue de 142 ms. La imagen se compone de 1.200 líneas.

Cada línea de la exploración corresponde a la fluctuación de la intensidad de la Ca 2 + Verde consta de 71 puntos tomados en un rango de 142 ms, y puede ser utilizado como una rápida lectura de las respuestas de calcio. Por ejemplo, en la figura. 3 se muestra la actividad de Ca 2 + de una sola línea de un cardiomiocito individual, según lo medido por Ca 2 + intensidad de la fluorescencia verde en función del tiempo en segundos antes (arriba) y después (abajo) la adición de carbacol M 5, que mejora la el nivel de Ca 2 + intracelular a través de Gα q-PLCβ actividad. Cuando varias líneas son un promedio, la estimulación carbacol produce un aumento de ~ 1,8 veces en Ca 2 + intensidad de verde. Debido a las variaciones en las condiciones experimentales (temperatura ambiente, la potencia del láser, la respuesta del detector, la distribución de tinta, etc), este aumento no puede ser visto en personalíneas de barrido. A pesar de que los valores de intensidad (valores y ejes) son similares, es claro que la trama estimulada por carbacol en la parte inferior tiene picos mucho más amplio, que corresponde a los niveles de calcio más sostenido, que los picos de fluctuación estrecha visto antes de la estimulación. Este aumento relativo en la ampliación y la intensidad oculta oscilaciones pequeñas, más lento. Nuestro objetivo es discriminar mejor entre estos diferentes tipos aparente de las fluctuaciones de calcio.

Otro ejemplo de estas fluctuaciones rápidas de calcio se muestra en la fig. 4. El gráfico superior muestra los datos en bruto de la línea de cardiomiocitos ventriculares estimulados (rojo) y un promedio de 3 rastros línea se muestra en negro. Para determinar la medida en que estas fluctuaciones de calcio fueron mediadas por Gα q - caveoline3 interacciones, microinyección de un péptido que desestabiliza la caveolina-3 - Gα interacciones q (es decir, CAV3 péptido) que elimina el tiempo de Ca 2 + actual, y estos datos se muestran en azul(Que tenga en cuenta que restan 500 de la CAV3 intensidades péptido para que las dos trazas se pueden discernir mejor).

Nos importan las columnas de datos en bruto de nuestros archivos de Excel en Sigmaplot (Jandel, Inc.) y lleva a cabo un análisis de histogramas. En este análisis, el número de eventos se agrupan en un número igual de cajas (cajas) para producir un histograma. La anchura de bin representa un intervalo de tiempo igual. Las intensidades se insertan en el tiempo diferentes se une de manera que la altura de una caja en particular representa el número de veces que la intensidad se produce en la ventana de tiempo en particular. Dado que este tipo de análisis sólo depende de la recolección de datos a la velocidad de barrido mismo, muchas huellas se pueden analizar de forma simultánea. Además, este análisis no es sensible a las diferencias en los niveles de tinta, láser de potencia, etc, y el ruido electrónico y de fondo se produce a escalas de tiempo muy rápido y sólo se ven en los primeros 1-2 cubos.

El histogra correspondientems de los datos en bruto en la figura. 4 se muestran en la parte inferior de la página. El histograma para el control de las células se distribuyen en un gran número de contenedores que corresponde a una distribución de tiempo amplio, como se muestra por la línea roja (la línea es para guiar a los ojos y no se asume el modelo). Por el contrario, los contenedores para la respuesta de las células donde se interrumpió el Gα q-CAV3 interacción péptido se limitan a una distribución bin estrecho que sugiere que la presencia del péptido elimina ya los flujos de duración. La microinyección de un péptido de control que no interrumpa Gα q-CAV3 produce un histograma similar a la ONU con inyección de células 8.

En la figura. 5 se compara la intensidad de las fluctuaciones rápidas de Ca 2 + Verde en adultos cardiomiocitos ventriculares caninas (izquierda) y fresco, sin estimular cardiomiocitos de rata neonatal que carecen de caveolas (derecha). Aquí, los histogramas de las intensidades correspondientes durante un período de tres minutos fueron agrupadas a 35 para ver los eventos más lento de calcio. Tenga en cuenta que los cardiomiocitos neonatales mostrar las fluctuaciones de velocidad en una línea de base plana que muestra la falta de Ca 2 + más lenta la actividad, mientras que una línea de base más estructurada es visto por las células adultas. Estas diferencias son más fáciles de ver en los histogramas.

Figura 1
Imágenes Figura 1. Canina de cardiomiocitos adultos ventricular muestra la distribución de Gα q immunolabeled con Alexa-488 en Alexa-488 se entusiasma con 488nm de iones de argón láser de línea y la imagen se ha grabado con filtro de emisión BP505-530nm. La parte superior derecha es la misma imagen de visualización de la localización de la caveolina-3 immunolabeled con Alexa-647, entusiasmados con la línea de 633-nm de uno Él:. Ne láser y grabado con LP650 nm de emisión filtro La imagen combinada en colocalización se ve de color naranja se encuentra en la parte inferior izquierda con una imagen ampliada a la derecha.

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Figura 2
Figura 2. Imagen de calcio de la vida canina cardiomiocitos ventriculares adultos cargados de Ca 2 + Verde. La imagen fue tomada en un sistema de microscopía confocal de barrido láser con un objetivo de 40x usando un láser de 488nm de iones de argón y un filtro de emisión LP515. La imagen se compone de 1.200 líneas, el píxel tiempo de permanencia fue de 2 ms, y el tamaño del pixel fue de 0,1 micras.

Figura 3
Figura 3. Fluctuaciones TOP intensidad de un seguimiento de la línea de la vida canina cardiomiocitos ventriculares adultos cargados de Ca 2 + verde y la imagen como se describe, y BOTTOM la misma célula estimulada por la adición de 5 M carbacol.

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Figura 4. TOP Un ejemplo de trazas la línea de la vida canina cardiomiocitos ventriculares adultos cargados de Ca 2 + verde (rojo) tomados de más de 180 ms, donde se muestra el promedio de 3 se hace referencia como una línea de negro, y en comparación con una célula que se microinyectó con un péptido que altera Gα q-caveolina 3 asociación (rojo) en un promedio de tres trazos en negro. Tomamos nota de que restamos 400 cuenta la intensidad del conjunto menor de datos para fines de visualización. Los paneles inferiores son los histogramas de los datos correspondientes desechado como se describe en el texto, y donde el número bin es arbitraria y el número de bin (o, simplemente, contar) se corresponde con la cantidad total de la intensidad en que Bin particular. Tomamos nota de que las líneas de la línea roja y azul dibujada en el control (izquierda) y los histogramas de péptidos (derecha) para permitir la fácil identificación y comparación de los datos y no hay un modelo que se supone.

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Figura 5. Fluctuaciones de intensidad de Ca 2 + Verde en adultos cardiomiocitos ventriculares caninas (izquierda) y fresco, sin estimular cardiomiocitos de rata neonatal que carecen de caveolas (derecha) y sus correspondientes histogramas se muestran a continuación.

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Discussion

Hemos desarrollado un método para ver y aislar las señales rápidas de calcio en los cardiomiocitos de vida. Si bien las condiciones experimentales de estas mediciones han sido previamente aplicada a otros sistemas celulares 10, así como los cardiomiocitos 11, el uso de histogramas y análisis bin permite que los datos de muchos de Ca 2 + eventos a ser adquiridos. Más rápido los acontecimientos pueden ser fácilmente aislados de los más lentos y modelos adaptados a comprender sus mecanismos subyacentes. Cardiomiocitos cultivo, ya que muchas líneas de células primarias, puede ser difícil. Aunque en general se cree que las medidas deben ser tomadas inmediatamente después de que las células sean adquiridos, hemos encontrado que los cardiomiocitos adultos canina que se utilizó en este estudio sólo comienzan a perder sus propiedades específicas después de 3 días. Este período de tiempo más largo permite que las células se adhieren firmemente sobre el soporte asegurando que las células sobrevivan tratamientos potencialmente letales como la microinyección. Un firme apego es fundamentalpara el éxito de la microinyección.

Se verificó el papel de la caveolina-Gα q 3 asociación en los flujos de calcio por la microinyección de un péptido que altera su interacción. Nos gustaría hacer hincapié en que la microinyección debe hacerse con sumo cuidado para minimizar el daño de la célula y el escape del contenido celular. Sin embargo, estos riesgos deben ser equilibradas por el uso de agujas de mayor diámetro que se necesitan para entregar una cantidad suficiente de material en los cardiomiocitos relativamente grande. La inclusión de un colorante como DAPI que permite hacer un seguimiento que las células han sido microinyección es importante. Como se ha mencionado, es importante que para los miocitos microinyección se bañan en medio libre de calcio y que las soluciones inyectadas también es libre de calcio. Entrada de calcio extracelular inicia las contracciones y la posterior muerte de las células

Las mediciones se pueden adaptar a otros tipos de células, los tintes y el láser confocalsistemas para seguir otros eventos celular rápida como insoitol 1,4,5 trisphospate y los flujos de campo, aunque el Ca 2 + flujos son sin duda uno de los mensajeros celulares más complejas. Uno debe ser cauteloso sobre la elección de indicadores fluorescentes que no son fácilmente photobleached y tener una respuesta de fluorescencia robusto y dinámico a fin de que los poderes láser de baja se puede utilizar. Láser de baja potencia también evitar el calentamiento de locales, que podrían dar lugar a efectos no deseados en celulares.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 2R01 GM53132 y GM071558 P50.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen ABCD1234

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