संवेदी न्यूरॉन Dendrites में सूक्ष्मनलिकाएं Immunohistological लेबल, Tracheae, और मांसपेशियों में ड्रोसोफिला लार्वा शारीरिक दीवार

Neuroscience

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Summary

समझ कैसे neuronal dendrites के रूप में जटिल सेल आकार, विकास के दौरान प्राप्त कर रहे हैं, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सही परख microtubule संगठन करने में सक्षम हो. यहाँ हम एक मजबूत immunohistological लेबलिंग वृक्ष के समान द्रुमायण न्यूरॉन संवेदी dendrites के microtubule संगठन, ट्रेकिआ, मांसपेशियों की जांच के लिए विधि का वर्णन, और अन्य

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Yalgin, C., Karim, M. R., Moore, A. W. Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall. J. Vis. Exp. (57), e3662, doi:10.3791/3662 (2011).

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Abstract

समझ कैसे जटिल सेल आकार में मतभेद प्राप्त कर रहे हैं, यह महत्वपूर्ण है सही microtubule संगठन का पालन करें. ड्रोसोफिला लार्वा शरीर दीवार में कई प्रकार की कोशिकाओं है कि सेल और ऊतक morphogenesis का अध्ययन करने के लिए मॉडल हैं हैं. उदाहरण के लिए tracheae ट्यूब 1 morphogenesis, और ड्रोसोफिला लार्वा का संवेदी न्यूरॉन्स एक प्राथमिक प्रणाली सामान्य और वृक्ष के समान भेदभाव 2-5 और 6 अध: पतन के न्यूरॉन वर्ग विशेष तंत्र की व्याख्या के लिए बन गए हैं वृक्ष के समान द्रुमायण (डीए) की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है .

dendrite शाखाओं के आकार में काफी न्यूरॉन वर्गों के बीच में भिन्नता है, कर सकते हैं और एक एकल 7,8 न्यूरॉन के विभिन्न शाखाओं के बीच भी. डीए न्यूरॉन्स में आनुवंशिक अध्ययन का सुझाव है कि अंतर cytoskeletal संगठन वृक्ष के समान शाखा 4,9-11 आकार में रूपात्मक मतभेद आबाद कर सकते हैं. हम एक के लिए एक मजबूत प्रतिरक्षाविज्ञानी लेबलिंग विधि प्रदान करते हैंvivo डीए संवेदी न्यूरॉन dendrite कुंज में microtubule संगठन (आंकड़े 1, 2, 1 मूवी) में ssay. इस प्रोटोकॉल विच्छेदन और पहली instar लार्वा के immunostaining, एक मंच है जब सक्रिय संवेदी न्यूरॉन dendrite परिणाम और शाखाओं में बंटी संगठन 12,13 उत्पन्न हो रही है दिखाता है .

संवेदी न्यूरॉन्स को धुंधला करने के अलावा, इस पद्धति मजबूत मांसपेशियों में microtubule संगठन की लेबलिंग (सिनेमा 2, 3), (चित्रा 3, मूवी 3) ट्रेकिआ, और शरीर के अन्य दीवार के ऊतकों को प्राप्त होता है. यह बगल में शरीर दीवार में microtubule संगठन तंत्र है कि जब जांच का विश्लेषण करने के इच्छुक जांचकर्ताओं के लिए मूल्यवान है नियंत्रण ऊतकों और सेल आकार.

Protocol

1. अभिकर्मकों की तैयारी

शुरुआत से पहले नोट: विच्छेदन और immunohistochemical धुंधला हो जाना एक चुंबकीय कक्ष में किया जाता है और लार्वा नीचे टिकी विशेष आकार का कीट पिन का उपयोग कर. एक चुंबकीय कक्ष के निर्माण, और इन पिनों की तैयारी पर विस्तृत निर्देश संबंधित 14,15 संदर्भ में पाया जा सकता है है . संक्षेप में, एक 1x1cm वर्ग छेद एक चुंबकीय पत्रक और एक एक छोटे से कक्ष बना शीट के पीछे करने के लिए चिपका coverslip में कटौती है. चैम्बर के पक्ष epoxy गोंद के साथ सील कर रहे हैं, के बाद इस गोंद की स्थापना की है चैम्बर उपयोग करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ कई बार धोया जाता है. विच्छेदन कीट पिंस अपेक्षित आकार करने के लिए झुकने से तैयार हैं और फिर एक धातु 14,15 टैब पर चिपके. एक धातु टैब पर वैकल्पिक रूप से, हम एक संभाल के साथ एक कट ऑफ पीले सिरे से बनाया एक औंधा स्टील के फ्लैट सिर ड्राइंग पिन का इस्तेमाल किया है. इस चुंबकीय चैम्बर व्यवस्था के उपयोग की अनुमति देता है ove करीबी नियंत्रणआर पिन स्थिति और ऊतकों को विच्छेदन के दौरान खींच.

डीए न्यूरॉन्स जांचकर्ताओं के विभिन्न सबसेट में रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए कई अलग अलग Gal4 लाइनें (शिमोनो और 16 सहयोगियों द्वारा संक्षेप) का उपयोग कर सकते हैं. इन लाइनों के कई सार्वजनिक शेयर केन्द्रों से उपलब्ध हैं. इस प्रतिनिधि प्रोटोकॉल में, हम बाहर ले जाने के एक पंक्ति जिसमें डीए न्यूरॉन के दो परस्पर विरोधी वर्गों सह चिह्नित कर रहे हैं की immunostaining: सबसे सरल श्रेणी मैं और सबसे जटिल वर्ग (चतुर्थ P10-Gal4 17,18, यूएएस mCD8:: Kusabira, ऑरेंज (को)).

  1. Ca + मुक्त + HL3.1 खारा तैयार
    1. मिमी में: 70 NaCl, 5 KCl, 20 2 MgCl, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 sucrose, और 5 Trehalose, पीएच 19 7.2. फ़िल्टर बाँझ और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस नोट: Ca + + मुक्त समाधान विच्छेदन के दौरान मांसपेशियों में संकुचन रोकता है .
  2. 2x PHEM बफर तैयार
    1. मिमी में: 130 पाइप, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, पीएच 7.0. फ़िल्टर बाँझ और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस

      नोट: इन सामग्रियों जब तक पीएच 7.0 दृष्टिकोण भंग नहीं होगा.

  3. लगानेवाला हौसले तुरंत तैयार निर्धारण से पहले.
    1. आदेश में एक 50ml फाल्कन ट्यूब में एक 25ml समाधान, पहली मिश्रण 2g paraformaldehyde, 100μl 1M NaOH और 10ml पानी तैयार करने के लिए.
    2. प्रकार के बरतन के साथ एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में लगानेवाला हिलाओ जब तक समाधान स्पष्ट है. (कुल मात्रा के बारे में 11.5 मिलीलीटर हो जाएगा.)
    3. बर्फ पर कूल लगानेवाला.
    4. 12.5ml 2x PHEM बफर जोड़ें.
    5. 7.0 करने के लिए 1M एचसीएल के साथ पीएच को समायोजित करें.
    6. पानी के साथ समाधान भरें जब तक मात्रा 25ml है.
    7. वाटमान कागज का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर.

2. लारवल विच्छेदन

शुरुआत से पहले नोट: microtubule नेटवर्क, और विशेष रूप से उन संवेदी dendrites में, टूटने विच्छेदन की दीक्षा के बाद तेजी से होगा. एसीकम से कम पाँच मिनट बाद तत्काल निर्धारण में तेजी से विच्छेदन hieving इस प्रोटोकॉल की सफलता में महत्वपूर्ण कारक हैं.

  1. लार्वा पानी में धो और जल्दी से उन्हें इस बाल की एक पाश का उपयोग बूंद में कदम.
  2. ओरिएंट लार्वा पृष्ठीय पक्ष और ventral पक्ष पर कांच ऊपर. नोट: यह अभिविन्यास वेंट्रल क्लस्टर न्यूरॉन्स की जांच है. पृष्ठीय क्लस्टर न्यूरॉन्स की जांच करने के लिए, ओरिएंटेशन पलटना.
  3. मुँह हुक के पास पूर्वकाल अंत पिन केंद्र कीट - पिन का उपयोग करने के लिए. सर्वोत्तम परिणामों के लिए अंत के करीब पिन प्लेस.
  4. विच्छेदन कक्ष में HL3.1 खारा की एक बूंद रखें.
  5. लार्वा के बहुत पीछे टिप microscissors के साथ बंद कट. नोट: यह कदम लार्वा कि microscissors (2.7 कदम) के लिए उपयोग की अनुमति होगी के पीछे अंत में एक एपर्चर को खोलता है.
  6. पेट के क्षेत्र कि अब एपर्चर के लार्वा के पीछे अंत में बाहर poking संदंश के साथ ले लो. धीरे पूरे आंत बाहर खींच.
  7. जगहएपर्चर और पूर्वकाल की ओर वेंट्रल midline साथ कटौती के माध्यम से microscissors की एक ब्लेड की नोक.
  8. कोने पिन का उपयोग करना, अब मुफ्त कोनों, पीछे, पहले तो पूर्वकाल पिन. इसके साथ ही धीरे लार्वा पट्टिका खुला खिंचाव.

3. फिक्सेशन, अवरुद्ध, धुंधला हो जाना, और लार्वा fillets के बढ़ते

शुरुआत से पहले नोट: सभी निर्धारण और धुंधला कदम विच्छेदन कक्ष में किया जाता है. इस प्रक्रिया के दौरान, कीट लार्वा धारण के रूप में यह ऊतकों को नुकसान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं पिन दस्तक नहीं सावधान रहना. बाहर सुखाने से प्रयोग को रोकने के लिए, एक छोटी सी Tupperware सिक्त ऊतकों से घिरे कंटेनर में सभी धुंधला कदम.

  1. Ca + + मुक्त HL3.1 एक पीले रंग की टिप का उपयोग कर बफर महाप्राण (व्यंजन ). तुरंत दूसरे pipetteman लगानेवाला का उपयोग कर जोड़ें.
  2. धीरे विंदुक ऊपर और नीचे Ca + मुक्त + HL3.1 बफर के शेष निशान के साथ लगानेवाला मिश्रणचैम्बर में. तत्काल यह महाप्राण (व्यंजन) और तब कक्ष में ताजा लगानेवाला जोड़ने.
  3. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  4. PBST में 6x 10mins (0.1% ट्राइटन पीबीएस में X-100) धो लें.
  5. 5% PBST में आरटी पर 20 मिनट के लिए बकरी सीरम के साथ ब्लॉक.
  6. 5% PBST में बकरी सीरम में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध समाधान बदलें. प्राथमिक प्रयोग किया जाता एंटीबॉडी (DM1A) विरोधी α-ट्यूबिलिन और चूहा (5H10) विरोधी CD8 दोनों पतला 1 1000 / माउस हैं.

    नोट: अन्वेषक के लिए माउस (22C10) विरोधी Futsch 20,21 पतला कुछ परिस्थितियों में 1 / 1000 के साथ माउस ट्यूबिलिन - विरोधी α (DM1A) विकल्प (चर्चा देखें) इच्छा हो सकती है .

  7. रात 4 बजे (कम से कम 16h के लिए) सेते डिग्री सेल्सियस
  8. PBST में 6x 10mins धो लें.
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी 5% PBST में बकरी सीरम में पतला समाधान जोड़ें. माध्यमिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी एलेक्सा Fluor 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी और Cy3 गधा विरोधी चूहा आईजीजी हैं. Fluorophore रोकने के कवर नमूना रखें22 फोटो विरंजन.
  10. आरटी पर दो घंटे के लिए या तो सेते हैं या रात 4 बजे डिग्री सेल्सियस कमरे के तापमान पर एक घंटे के द्वारा पीछा किया.
  11. PBST में 6x 10mins धो लें.
  12. स्लाइड नीचे छल्ली साइड पर लार्वा पट्टिका प्लेस, 80% ग्लिसरॉल में माउंट, और एक 'जल्दी' माउंट के लिए नेल पॉलिश के साथ coverslip के पक्ष सील.
    नोट: सुधार ऊतक समाशोधन, और एक स्थायी स्थिर नमूना के लिए, DPX में माउंट के रूप में पहले 23 में वर्णित है .

4. प्रतिनिधि परिणाम:

प्रतिदीप्त धुंधला हो जाना एक confocal खुर्दबीन के तहत जांच की गई थी. आंकड़ों में एक dendrite कुंज के भीतर 1-2, विभिन्न शाखाओं अलग cytoskeletal संगठन है. चित्रा 1 1 सेंट instar लार्वा स्तर पर एक चतुर्थ श्रेणी डीए न्यूरॉन के कुंज के एक क्षेत्र से पता चलता है. पूरे कुंज mCD8 के साथ चिह्नित: KO और विरोधी एक एंटीबॉडी CD8 और फ्लोरोसेंट माध्यमिक (Cy3) का उपयोग पता लगाया. ट्यूबिलिन विरोधी एंटीबॉडी α ट्यूबिलिन और स्त्राव का उपयोग करने के लिए पता चला हैescent माध्यमिक (Alexa Fluor 488). मुख्य शाखाओं ट्यूबिलिन के लिए सकारात्मक रहे हैं, कुछ पतली पक्ष शाखाओं ट्यूबिलिन नकारात्मक हैं. 1 मूवी धारावाहिक वर्गों के एक वर्ग मैं डीए न्यूरॉन के एक समान धुंधला के माध्यम से एक सेट है. चित्रा 2 1 सेंट instar लार्वा स्तर पर Futsch और CD8 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग एक चतुर्थ श्रेणी डीए न्यूरॉन के कुंज के एक क्षेत्र से पता चलता है. मुख्य शाखाओं Futsch पॉजिटिव हैं, कुछ पतली पक्ष शाखाओं Futsch नकारात्मक हैं. चित्रा 3. लार्वा शरीर दीवार में Tracheae एक जटिल microtubule संगठन दिखाते हैं. सिनेमा 2 और 3 के शरीर दीवार मांसपेशियों और ट्रेकिआ के माध्यम से धुंधला के धारावाहिक वर्गों दिखा.

चित्रा 1
चित्रा 1. चित्र 1 1 सेंट instar लार्वा स्तर पर एक चतुर्थ श्रेणी डीए न्यूरॉन के कुंज के एक क्षेत्र से पता चलता है. : पूरे कुंज mCD8 साथ चिह्नित है: को और विरोधी CD8 एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक (Cy3) का उपयोग कर पता लगाया है. ट्यूबिलिन विरोधी एंड Tubuli का उपयोग करने के लिए पता चला हैn एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक (488 Alexa). पैनलों अनुक्रमिक confocal z वर्गों (0.5μm) एसी, C'- सी "(पीले arrowhead) के साथ या बिना सूक्ष्मनलिकाएं (बैंगनी arrowhead) डाला जाता है शाखाओं के पैनल सी. उदाहरण से एक एंटीबॉडी धुंधला अंतर्निहित में लाल arrowheads को उजागर सूक्ष्मनलिकाएं उपकला कोशिकाओं.

चित्रा 2
चित्रा 2. चित्र 2 1 सेंट instar लार्वा स्तर पर Futsch और CD8 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग एक चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन के कुंज के एक समान क्षेत्र से पता चलता है है. : पूरे कुंज mCD8 साथ चिह्नित है: को और विरोधी CD8 एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक (Cy3) का उपयोग कर पता लगाया है. Futsch विरोधी Futsch एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक (488 Alexa) का उपयोग करने के लिए पता चला है. मुख्य शाखाओं Futsch पॉजिटिव हैं, कुछ पतली पक्ष शाखाओं Futsch नकारात्मक हैं. (पीले arrowhead) के साथ या बिना Futsch (बैंगनी arrowhead) शाखाओं का उदाहरण डाला जाता है.


चित्रा 3. ट्रेकिआ विरोधी ट्यूबिलिन ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग दाग. यह लार्वा तीसरे instar है और dissected के रूप में पहले 23,24 वर्णित मूवी 3 में एक वर्ग द्वारा चिह्नित फ़ील्ड से बढ़े हुए सीरियल वर्गों से पता चलता है..

1 मूवी सीरियल वर्गों एक वर्ग मैं न्यूरॉन के वृक्ष के समान कुंज भर ट्यूबिलिन धुंधला अनुरेखण. पूरे कुंज mCD8 के साथ चिह्नित: KO (मैजंटा) और विरोधी CD8 एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक (Cy3) का उपयोग कर पता लगाया है. ट्यूबिलिन (ग्रीन) एक एंटीबॉडी विरोधी α-ट्यूबिलिन और फ्लोरोसेंट माध्यमिक (Alexa Fluor 488) का उपयोग कर पता चला है. स्केल: वीडियो छवि के एक तरफ अनुभाग में 46.88μm से मेल खाती है. मूवी देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

2 फिल्म के सीरियल bod में ट्यूबिलिन धुंधला अनुरेखण वर्गोंy एक तिहाई instar लार्वा की दीवार की मांसपेशियों. ट्यूबिलिन विरोधी α-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक (Alexa Fluor 488) का उपयोग कर पता चला है. स्केल: वीडियो छवि के एक तरफ अनुभाग में 46.88μm से मेल खाती है. मूवी देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

मूवी 3 सीरियल में एक तिहाई instar लार्वा की एक शरीर दीवार ट्रेकिआ, Figure.3 में एक वर्ग के साथ चिह्नित ट्यूबिलिन धुंधला अनुरेखण वर्गों . ट्यूबिलिन विरोधी α-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट माध्यमिक (Alexa Fluor 488) का उपयोग कर पता चला है. स्केल: वीडियो छवि के एक तरफ अनुभाग में 46.88μm से मेल खाती है. मूवी देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

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Discussion

समझ कैसे जटिल सेल आकृतियों इसे प्राप्त कर रहे हैं करने के लिए सही परख microtubule संगठन के लिए सक्षम होना महत्वपूर्ण है. यहाँ हम परख वृक्ष के समान द्रुमायण न्यूरॉन संवेदी dendrites के microtubule संगठन के लिए एक मजबूत immunohistological लेबलिंग विधि का वर्णन. धुंधला संवेदी न्यूरॉन्स के अलावा, इस पद्धति ट्रेकिआ, मांसपेशियों और शरीर के अन्य दीवार के ऊतकों की मजबूत immunohistological धुंधला प्राप्त होता है.

हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए डीए न्यूरॉन्स के विकास संवेदी dendrites में microtubule संगठन की जांच. इन dendrites बहुत चोट या तनाव 25 के प्रति संवेदनशील हैं, और 23 विच्छेदन की शुरुआत के बाद तेजी से नीचे तोड़ने. विच्छेदन पांच मिनट या उससे कम में बाहर किया जाना चाहिए. ट्रेकिआ और शरीर के अन्य दीवार के ऊतकों में सूक्ष्मनलिकाएं और अधिक स्थिर हैं. इस प्रोटोकॉल इस्तेमाल किया neuromuscular जंक्शन 14,15 के विश्लेषण के लिए लार्वा fillets तैयार उन से अनुकूलित है, और जल्दी च के लिए अनुकूलित हैएक तेजी से विच्छेदन के बाद ixation.

जब डीए न्यूरॉन्स, overlying मांसपेशियों में मजबूत विरोधी ट्यूबिलिन धुंधला, और अंतर्निहित उपकला कोशिकाओं 26 के dendrites का विश्लेषण एक जटिल धुंधला पैटर्न (1 चित्रा, Movie1) करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं . इसलिए कई धारावाहिक वर्गों के माध्यम से वृक्ष के समान धुंधला (Movie1) की अनुरेखण सावधान डीए न्यूरॉन dendrite कुंज में microtubule संगठन के एक पूर्ण विश्लेषण के लिए आवश्यक हो सकता है. MAP1B, Futsch 20,21 के विशिष्ट ड्रोसोफिला सजात मोनोक्लोनल एंटीबॉडी भी ड्रोसोफिला परिधीय तंत्रिका प्रणाली 5,9,20 में microtubule cytoskeleton लेबल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Futsch केवल न्यूरॉन्स में व्यक्त की है और इसलिए यह α ट्यूबिलिन (चित्रा 2) की तुलना में एक कम जटिल धुंधला पैटर्न का उत्पादन. GFP-टैग - अंतर्जात - ताउ डीए न्यूरॉन वृक्ष के समान सूक्ष्मनलिकाएं 27 के एक मार्कर के रूप में भी इस्तेमाल किया गया. इन मार्करों का उपयोग करने के लिए प्रभावी है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वें के अक्षतंतु टर्मिनी मेंई neuromuscular जंक्शन Futsch विशेष रूप से बंडल सूक्ष्मनलिकाएं 28 लेबल. Futsch, ताउ, और डीए dendrites में सूक्ष्मनलिकाएं के बीच सटीक स्थानिक रिश्तों को अभी तक कर रहे हैं के लिए पूरी तरह से लक्षण वर्णन किया जा. इस प्रोटोकॉल में हम अंतर्जात microtubule संगठन को संबोधित किया है. यह भी लेबल GFP ताउ टैग या ट्यूबिलिन की overexpression का उपयोग सूक्ष्मनलिकाएं के लिए संभव है. केयर अप्रत्याशित phenotypes उत्प्रेरण जब overexpression दृष्टिकोण 29 उपयोग किया जाता है के खिलाफ लिया जाना चाहिए .

हमारे हाथ में, डीए न्यूरॉन्स और शरीर के अन्य दीवार के ऊतकों में सूक्ष्मनलिकाएं के immunohistochemical धुंधला सबसे अच्छा हासिल की है जब विरोधी ट्यूबिलिन प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया माध्यमिक एंटीबॉडी जैसे Alexa 488 Fluor आसानी से कल्पना fluorophore करने के लिए युग्मित है. इसलिए जब ट्रांसजेनिक उपकरण का उपयोग करने के लिए विरोधी ट्यूबिलिन Gal4/UAS प्रणाली, LexA प्रणाली, या 23 MARCM और MARCM डेरिवेटिव में के माध्यम से लेबलिंग जैसे के साथ संगीत कार्यक्रम में डीए न्यूरॉन्स लेबल, हम साथ मार्कर प्रोटीन पसंद: चेरी और mCD8:: को इस द्वितीयक, mCD8 जैसे के साथ वर्णक्रमीय ओवरलैप के बाहर.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

हम वित्त पोषण के लिए आरआईकेईएन धन्यवाद. P10-Gal4 Alain विन्सेन्ट (Université पॉल Sabatier, टूलूज़, फ्रांस) की एक तरह का उपहार था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps Dumont 11251-20
Microscissors Fine Science Tools 15000-08
Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) Sigma-Aldrich T9026 Dilution 1/1000
Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant Developmental Studies Hybridoma Bank 22C10 Dilution 1/1000
Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) Caltag MCD0800 Dilution 1/1000
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG Invitrogen A-11001 Dilution 1/500
Cy3 anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch 712-166-150 Dilution 1/200

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References

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