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भ्रूण चिकी रेटिना में ओवो electroporation में

Biology

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Summary

इस वीडियो के समग्र लक्ष्य को दिखाने के लिए कैसे लक्षित रेटिना इंजेक्शन के प्रदर्शन करने के लिए है और

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Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina. J. Vis. Exp. (60), e3792, doi:10.3791/3792 (2012).

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Abstract

चिकन भ्रूण रेटिना उच्च रीढ़ में रेटिना विकास का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है. बड़े आकार और बाहरी विकास की वजह से, यह अपेक्षाकृत बहुत आसान है लड़की भ्रूण पुनः संयोजक डीएनए / आरएनए प्रौद्योगिकी का उपयोग रेटिना में हेरफेर. डीएनए / आरएनए constructs के भ्रूण रेटिना में electroporation स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं रेटिना के में रेटिनल विकास के दौरान जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक महान लाभ है. रिपोर्टर जीन परख, अभिव्यक्ति से अधिक जीन, जीन नीचे दस्तक (shRNA) आदि के रूप में assays के विभिन्न प्रकार electroporation तकनीक का उपयोग किया जा सकता है. इस वीडियो लक्षित रेटिना इंजेक्शन को दर्शाता है और भ्रूण लड़की रेटिना में ओवो electroporation में हैम्बर्गर और हैमिल्टन 22-23 मंच, जो भ्रूण 4 दिन (E4) के बारे में है. यहाँ हम ओवो electroporation तकनीक में तेजी और सुविधाजनक शो जिससे एक प्लास्मिड डीएनए है कि एक मार्कर के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त सीधे में कर दिया हैलड़की भ्रूण subretinal अंतरिक्ष और बिजली दालों के बाद रेटिना स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के डीएनए तेज की सुविधा. रेटिना और E4 पर इंजेक्शन electroporation की नई विधि देर जन्मे 1 न्यूरॉन्स, जो इंजेक्शन और electroporation की पारंपरिक विधि के साथ मुश्किल 2 E1.5 पर किया गया है सहित सभी रेटिना सेल प्रकार, दृश्य की अनुमति देता है.

Protocol

के बाद से प्रोटोकॉल के कुछ भागों के रूप में मामूली संशोधन के साथ पहले से अन्य जौव 2 वीडियो और 3 कागजात में वर्णित प्रदर्शन कर रहे हैं हम यहाँ विस्तार में उन पर चर्चा करेंगे.

1. अंडा हैंडलिंग और सुई तैयार

  1. अंडे एक शराब में संग्रहीत किया जा सकता है कूलर के बारे में 13 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए. यदि तापमान बहुत अधिक है, भ्रूण असामान्य रूप से विकसित करने के लिए शुरू, जबकि कम तापमान उच्च मृत्यु दर का कारण बनता है. एक बार जब आप वाइन कूलर से अंडे सेते हैं बाहर ले और अंडे खड़ी बड़ा अंत के साथ सेट अप करने के लिए तैयार हैं. कमरे के तापमान में अंडे उन्हें 37.5 ° सी इनक्यूबेटर में डालने से पहले कम से कम 2 घंटे के लिए रखें.
  2. 96-100 घंटे जो भ्रूण 4 दिन के बारे में है भ्रूण कि हैम्बर्गर और 22 4-5 हैमिल्टन मंच पर हैं प्राप्त करने के लिए अंडों को सेते हैं.
  3. तैयार खींच गिलास केशिका ट्यूब से micropipette सुई और विदारक सूक्ष्म के तहत टिप तोड़व्यास में 0.1 माइक्रोन और 20 मिमी घटना के बारे में एक टिप खोलने चिमटी के साथ गुंजाइश. बड़े युक्तियों के साथ सुई पीतक झिल्ली भेदी जबकि छोटे सुझावों में कठिनाई होती है लोड हो रहा है और डीएनए समाधान पहुंचाने में कठिनाई होती है.
  4. एक 0.1 मिलीग्राम हैमिल्टन Gastight micromanipulator पर घुड़सवार सिरिंज सुई देते हैं. सिरिंज सुई संलग्न करने के लिए एक Masterplex सिलिकॉन ट्यूब का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करें. के बाद से कनेक्शन कर रहे हैं तंग कोई खनिज तेल जोड़ने के लिए इस लगाव को सील करने की जरूरत है.
  5. संवाददाता प्लास्मिड डीएनए समाधान के 2 μl मिश्रण एक 3-6 μg / μl और parafilm का एक टुकड़ा पर तेजी से हरे रंग (0.025%) 0.2 μl लेकर एकाग्रता के साथ. फास्ट हरे रंग इंजेक्शन कल्पना करने में मदद करेगा. धीरे - धीरे मिश्रण के साथ सुई लोड.
  6. भीतर की झिल्ली से पीतक झिल्ली मुक्त अंडा धीरे 180 ° के बारे में बारी बारी से और प्रतीक्षा के लिए कुछ ही मिनटों तो यह बारी बारी से वापस मूल स्थिति के लिए और यह electroporation के लिए सेट.
  7. Forc पोछो70% इथेनॉल के साथ eps और अंडा खोल करने के लिए भ्रूण को संक्रमण से बचने.
  8. अंडा पर तुरंत संदंश ए.ए. आकार की एक जोड़ी के साथ हवा सेल ऊपर एक छोटा सा छेद करना. अंडा खोल दरार नहीं सावधान रहो. छोटे टुकड़ों के लिए एक छोटी सी खिड़की बनाने के लिए एक समय में एक निकालें. ध्यान से आंतरिक पीतक झिल्ली को छू के बिना संदंश का उपयोग झिल्ली को हटा दें.

2. इंजेक्शन और electroporation

  1. मस्तिष्क या दिल, सुई विपरीत स्थिति रक्त वाहिकाओं के आँख में प्रवेश करने और चोंच की ओर इशारा करते हुए मुख्य बंडल करने के लिए पार्श्व के नुकसान को रोकने.
  2. पियर्स पीतक झिल्ली, श्वेतपटल, रेटिना और सुई की एक अचानक हल्के धक्का से कांच का हास्य के माध्यम से. यदि सुई आँख के दूसरे सिरे के माध्यम से pierces यह ठीक हो सकता है जब तक यह नुकसान किसी भी प्रमुख खून नस चाहिए.
  3. धीरे धीरे वापस खोलने के किनारे पर सुई खींचने के लिए और यह लगभग नेत्रगोलक की बाहरी दीवार के स्पर्श करने के लिए जगह है.
  4. Inserसुई टी श्वेतपटल और रेटिना के बीच उप रेटिना अंतरिक्ष में.
  5. डीएनए इंजेक्षन जब तक आप हरे रंग की नेत्रगोलक की ओर भरने और एक उभाड़ना बनाकर रेटिना के अंदर की ओर धक्का समाधान कल्पना कर सकते हैं.
  6. यदि आपका सुई रखने सही नहीं है तो आप डीएनए कांच का हास्य आंख गेंद के बीच भरने के अंदर फैल समाधान देखेंगे. इसके अलावा, अगर आप रेटिना को नुकसान पहुंचा बहुत ज्यादा तो आप डीएनए समाधान नेत्रगोलक के बाहर आ रहा है देखेंगे.
  7. धीरे से सुई को हटाने और तुरंत अंडा अंदर समानांतर में पीबीएस में भिगोने के बाद इलेक्ट्रोड जगह. नीचे इलेक्ट्रोड एक तरीका है ताकि इंजेक्शन आँख इलेक्ट्रोड के बीच में स्थित है में डूब amniotic द्रव में धक्का. इलेक्ट्रोड के साथ किसी भी प्रमुख रक्त वाहिका या दिल को छू जबकि उन्हें रखने से बचें. नकारात्मक इलेक्ट्रोड इंजेक्शन के पक्ष में होना चाहिए ताकि डीएनए सकारात्मक इलेक्ट्रोड की ओर रेटिना उप रेटिना अंतरिक्ष में से जाया जा सकता है. इलेक्ट्रो15V की दालों के साथ 50 एम एस के लिए 5 950 एमएस के अंतराल के साथ के रेटिना porate.
  8. ध्यान से इलेक्ट्रोड हटाने और स्पष्ट स्कॉच टेप के टुकड़े के साथ अंडे की खिड़की मुहर.
  9. लेबल और यह डाल इनक्यूबेटर करने के लिए वापस से पहले इंजेक्शन अंडे की तारीख. आमतौर पर, के बारे में 3 से 5 मिनट लगते हैं पूरे electroporation प्रक्रिया को पूरा करने के लिए.
  10. GFP अभिव्यक्ति electroporation के बाद 8 घंटे के रूप में जल्दी के रूप में देखा जा सकता है. हालांकि, आप जब तक भ्रूण कटाई से पहले वांछित स्तर तक पहुँच प्रतीक्षा कर सकते हैं.

3. प्रतिनिधि परिणाम

हमारे अध्ययन में, हम विभिन्न प्लाज्मिड constructs का उपयोग करने के लिए जीन अभिव्यक्ति के नियमन का अध्ययन है कि रेटिना सेल के विकास शामिल है. इस वीडियो में pCAG GFP (अभिकर्मक नियंत्रण) करने के लिए एक सफल इंजेक्शन और electroporation का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, रिपोर्टर जीन (GFP है, आरएफपी आदि) के साथ किसी भी प्लास्मिड का निर्माण किया जा सकता. हालांकि GFP अभिव्यक्ति हाथी के बाद 8 घंटे के रूप में जल्दी के रूप में देखा जा सकता हैctroporation, हम आम तौर पर 6 दिन अंडा (E6) और उसके बाद कटाई शुरू करते हैं. Electroporated retinas के भ्रूण की dissected किया गया और एम्बेड और सेक्शनिंग पहले फ्लोरोसेंट विच्छेदन खुर्दबीन के तहत विश्लेषण. आमतौर पर, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति रेटिना की एक तिमाही में कम से कम एक सफल electroporation (चित्र 1) के बाद देखा जा सकता है. ट्रांसफ़ेक्ट रेटिना के ऊतकों और सेल morphologies का स्पष्ट दृश्य के लिए प्रोटोकॉल के माध्यम से विश्लेषण किया गया. Immunohistochemistry सेल प्रकार विशिष्ट (Brn3a, आदि Pax6) सेल विशेष GFP अभिव्यक्ति की अनुमति लक्षण वर्णन मार्करों (चित्र 2) का उपयोग कर.


आकृति 1. संवाददाता प्लाज्मिड परिणाम सकारात्मक GFP अभिव्यक्ति की सफल electroporation चिकन भ्रूण retinas. और इंजेक्शन गया electroporated और भ्रूण 4 दिन में भ्रूण 6 दिन में काटा. रेटिना के कम से कम 25% सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था (एक = शीर्ष देखने के लिए, बी= नीचे देखें). बार = 1mm स्केल.


चित्रा 2. GFP की विशेषता रेटिना की कोशिकाओं का उपयोग कर immunohistochemistry व्यक्त E7 चरण में रेटिना के ऊतकों को व्यक्त GFP तय की और sectioned थे. इन वर्गों तो विभिन्न सेल विशिष्ट मार्कर के साथ दाग रहे थे. Brn3a नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (ए) जबकि Pax6 क्षैतिज लंबे प्रबर्धों से रहित है, और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (बी) का निर्धारण किया गया था निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. पैमाने बार = 50 माइक्रोन.

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Discussion

रेटिना इंजेक्शन लक्षित और E4 के स्तर पर भ्रूण रेटिना में ओवो electroporation में विशेष रूप से एकल कोशिका के स्तर पर सभी छह प्रमुख रेटिना सेल प्रकार की कल्पना करने की क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप रेटिनल पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं (~ E1.5) HH10 पर ओवो electroporation लक्ष्यीकरण. ऑप्टिक पुटिका कोशिकाओं कि है आँख फार्म विकसित transfect करने में सक्षम है. हालांकि, इन कोशिकाओं को इस समय एक बहुत ही उच्च कारोबार है और इस विधि रेटिना की कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं है. यह हो सकता है कि उच्च सेल कारोबार दर निरंतर स्थिर अभिव्यक्ति को रोकता है. E4 द्वारा, भ्रूण काफी विकसित है कि आँख के प्रमुख संरचनाओं का गठन कर रहे हैं, लेकिन सभी काफी युवा है कि रेटिना में कोशिकाओं के बहुमत अभी भी रेटिना स्टेम सेल हैं. यह विधि भी समारोह पढ़ाई की है, जहां ब्याज की एक जीन सामान्य विकास और / या रेटिना की बीमारी का अध्ययन करने के लिए लक्षित किया जा सकता है / नुकसान हासिल करने के लिए लागू किया जा सकता है.

के बाद हम हमारे में इस तकनीक को प्रकाशितपिछले 1 कागज, इस क्षेत्र में कई वैज्ञानिकों ने हमें इस तकनीक पर अधिक सहायता के लिए संपर्क किया. तो हम दृश्य के लिए इस वीडियो का निर्माण करने का फैसला किया. इसके अलावा, हमारी तकनीक में अग्रिम इस वीडियो में वर्णित हैं.

इस तकनीक को सफलतापूर्वक करने के लिए, निम्नलिखित महत्वपूर्ण कारकों का वर्णन करने के लायक हैं.

सबसे महत्वपूर्ण कारक subretinal अंतरिक्ष में सुई जगह ठीक है. सबसे पहले, एक सुई विपरीत आंख में प्रवेश करने और चोंच की ओर इशारा करते हुए रक्त वाहिकाओं के मुख्य बंडल करने के लिए पार्श्व संरेखित सावधान होने की जरूरत है. यह स्थिति लगभग दिल के समानांतर है और मस्तिष्क और हृदय को नुकसान करने के लिए मौका कम कर देता है. जब झिल्ली पीतक, श्वेतपटल, रेटिना और कांच का हास्य के माध्यम से भेदी, सुई दूर है और पियर्स किसी भी रक्त शिरा के माध्यम से यात्रा नहीं करना चाहिए. यदि सुई काफी तेज है तो यह कुछ प्रथाओं के साथ बहुत आसानी से किया जा सकता है. अगले कदम धीरे धीरे वापस वें खींच करने के लिए हैई सुई और यह रेटिना के उद्घाटन के किनारे पर स्थिति. वहाँ हमेशा एक मौका है यह पूरी तरह से बाहर खींच. अगर वह नहीं होना चाहिए, तो एक फिर से कोशिश उद्घाटन के अवसर पर सुई टिप वापस डाल सकते हैं. Subretinal अंतरिक्ष श्वेतपटल और रेटिना के बीच में सुई रखकर अभ्यास और धैर्य की आवश्यकता है. शुरुआत में, यह बहुत मुश्किल लग रहा है, लेकिन कुछ अभ्यास के साथ यह आसान हो जाता है. जबकि subretinal अंतरिक्ष के अंदर डीएनए समाधान इंजेक्शन, यह बहुत महत्वपूर्ण है उभाड़ना गठन का पालन करने के लिए. बाद में, हरी समाधान आंख की रूपरेखा भरने शुरू होता है, एक सफल इंजेक्शन का संकेत है. यदि समाधान दूर diffuses है या आंख के बीच में भरने शुरू होता है, कि एक गलत इंजेक्शन इंगित करता है जो एक सफल electroporation नहीं निकलेगा.

दूसरा पहलू है जो एक गिलास केशिका ट्यूब गर्मी खींच और टिप को तोड़ने के माध्यम से किया जाता है एक इष्टतम सुई का निर्माण है. बड़े युक्तियों के साथ सुई कठिनाई भेदी through पीतक झिल्ली जो रेटिना हानिकारक का मौका बढ़ जाती है. आमतौर पर तीव्र सुई युक्तियाँ इस उद्देश्य के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं. हालांकि, बहुत छोटे सुझावों के साथ सुई लोड हो रहा है और डीएनए पहुंचाने में कठिनाई होती है और वृद्धि के लिए नेत्र गोलक के अंदर नीचे तोड़ने का मौका है. इस कारण से हम व्यास में 0.1 माइक्रोन और 20 मिमी एक घटना पर एक टिप खोलने के साथ सुई बनाना. इसके अलावा, जबकि parafilm का एक टुकड़ा पर एक छोटी बूंद से डीएनए मिश्रण लोड हो रहा है, यह बहुत महत्वपूर्ण है करने के लिए तरल के अंतिम बिट लोड नहीं के रूप में यह सुई अंदर हो रही हवा की संभावना बढ़ जाती है.

अंत में, इलेक्ट्रोड रखने बहुत सफल electroporation को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. इलेक्ट्रोड समानांतर में रखा जाना चाहिए ताकि विकासशील आंख इलेक्ट्रोड के बीच स्थित है. अतिरिक्त सावधानी के किसी भी प्रमुख खून इलेक्ट्रोड के साथ या दिल वाहिकाओं को छूने से लिया जाना चाहिए. इनमें से किसी भी हानिकारक मौत के बाद एक सफल injecti भी भ्रूण के लिए परिणाम कर सकते हैंपर. इसके अलावा, दो आँखें अलग उन्मुख हैं. तो, यह ध्यान में रखा जाना करने के लिए इलेक्ट्रोड अभिविन्यास (सकारात्मक बनाम नकारात्मक) इतना बदल कि नकारात्मक इलेक्ट्रोड हमेशा इंजेक्शन पक्ष में बिजली के वर्तमान के तहत रेटिना की कोशिकाओं में डीएनए फैलाना अनुमति चाहिए.

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Disclosures

पशु प्रयोगों के सभी संस्थागत पशु की देखभाल और Rutgers विश्वविद्यालय में सुविधाएं समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.

Acknowledgements

हम अपने HD कैमरा का उपयोग (तोप VIXIA HFS100) के लिए श्री Maaz Enver धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के भाग में (EY018738) एनआईएच, स्पाइनल कॉर्ड अनुसंधान पर न्यू जर्सी आयोग (08-3074-SCR ई 0 और 10-3091-SCR-ई 0), और Busch जैव चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator GQF Manufacturing Model-1550 Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes World Precision Instruments, Inc. TW150F-4
0.1 ml syringe Hamilton Co Gastight 1710 Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing Cole-Parmer HV-96400-13 Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe
Tweezers Dumont AA
Micromanipulator World Precision Instruments, Inc. M3301-M3
Plasmid DNA pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Dilute it to 0.025 % with PBS
Pulse generator Harvard Apparatus BTX ECM 830 Square wave generator
Electrodes Harvard Apparatus BTX model 514 Our electrodes were spaced 3-5 mm apart
Monochrome Digital Camera Carl Zeiss, Inc. Axiocam MRM
Fluorescent Dissection Microscope Leica Microsystems Leica MZ16FA
Upright Fluorescence Microscope Carl Zeiss, Inc. Zeiss Axio Imager A1

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References

  1. Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
  2. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
  3. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
  4. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
  5. Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).

Comments

1 Comment

  1. Hi
    Do you think it would be possible to perform this teqnique on much older embryos, in ovo?
    How do you confirm that the injection was in place?

    Reply
    Posted by: Yael K.
    January 7, 2013 - 6:38 AM

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