Author Produced

I Ovo Elektroporation i embryonisk Chick Retina

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Det overordnede mål for denne video er at vise, hvordan du udfører målrettet retinal injektion og

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina. J. Vis. Exp. (60), e3792, doi:10.3791/3792 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kylling embryonale nethinden er et fremragende værktøj til at studere retinal udvikling i højere hvirveldyr. Grund af store størrelse og ekstern udvikling, er det forholdsvis meget nemt at manipulere den chick embryoniske nethinden anvendelse af rekombinant DNA / RNA-teknologi. Elektroporering af DNA / RNA konstrukter ind i den embryoniske nethinden have en stor fordel at studere genregulering i retinale stamceller / progenitor celler under retinal udviklingen. Forskellig type af assays såsom reportergen assay, gen over-ekspression, knock genet ned (shRNA) etc. kan udføres ved anvendelse af elektroporation teknikken. Denne video demonstrerer målrettede retinal indsprøjtning og in ovo elektroporering ind i den embryoniske kylling retina i det Hamburger og Hamilton stadium 22-23, hvilket er omkring embryonisk dag 4 (E4). Her viser vi en hurtig og bekvem in ovo elektroporering teknik, hvorved en plasmid-DNA der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) som en markør bliver direkte leveres ind ichick embryonisk subretinale rum og efterfulgt af elektriske impulser at lette DNA-optagelse ved retinale stam / progenitor celler. Den nye metode til retinal injektion og elektroporation ved E4 tillader visualisering af alle retinale celletyper, herunder den sene-fødte neuroner 1, som har været vanskeligt med den konventionelle metode af injektion og elektroporation ved E1.5 2.

Protocol

Da nogle dele af protokollen udføres som tidligere beskrevet i andre Jové videoer 2 og papirer 3 med mindre ændringer, vil vi ikke diskutere dem i detaljer her.

1. Æg Håndtering og Needle Forberedelse

  1. Æg kan lagres i en vin køligere ved ca 13 ° C i op til 1 uge. Hvis temperaturen er for høj, vil embryoner begynde at udvikle unormalt, medens lavere temperatur forårsager høj dødelighed. Når du er klar til at inkubere tage æggene fra vinkøler og sæt æggene lodret med den større ende op. Hold æggene i stuetemperatur i mindst 2 timer før du lægger dem i 37,5 ° C inkubator.
  2. Inkubér æg til 96-100 timer, hvilket er omkring embryonale dag 4 for at få embryoner, der er på Hamburger og Hamilton tidspunkt 22 4-5.
  3. Forbered Mikropipette nåle fra trukket glas kapillarrør og bryde spidsen under et dissekere mikrorækkevidde med en pincet til at få et tip åbning omkring 0,1 um i diameter og 20 mm koniske. Nåle med større spidser har svært gennemboring af vitellinmembranen mens mindre tip har vanskeligt lastning og levere den DNA-opløsning.
  4. Fastgør nålen til en 0,1 ml Hamilton-Gastæt sprøjte monteret på en mikromanipulator. Bruger en lille stykke Masterplex silikoneslange for påsætning af nål til sprøjten. Da tilslutningerne er tætte ingen grund til at tilføje mineralsk olie for at forsegle denne vedhæftede fil.
  5. Mix 2 pi reporter-plasmid-DNA opløsning med en koncentration i intervallet 3-6 ug / ul og 0,2 ul fast green (0,025%) på et stykke parafilm. Fast green farvestof vil bidrage til at visualisere injektionen. Langsomt, indlæse nålen med blandingen.
  6. For at frigøre vitellinmembranen fra den indre membran rotere ægget forsigtigt omkring 180 ° og vent et par minutter og drej det derefter tilbage til den oprindelige position og sæt den til elektroporation.
  7. Tør Forceps og æg råtank med 70% ethanol at undgå at infektion for at embryoet.
  8. Foretage en lille hul på ægget umiddelbart over luften cellen med et par størrelse AA pincet. Pas på ikke at knække skallen. Tag små stykker ad gangen for at gøre et lille vindue. Omhyggeligt fjerne den indre membran ved hjælp af de tangen uden at røre den vitellinmembranen.

2. Injektion og elektroporation

  1. For at undgå skade på hjernen eller hjertet, position nålen contra laterale til de vigtigste bundt af blodkar ind i øjet og peger mod næbbet.
  2. Gennembore gennem den vitellinmembranen, sclera, retina og corpus vitreum af en pludselig mild skub af nålen. Hvis nålen gennemborer gennem den anden ende af øjet bør det være alright medmindre det beskadiger ethvert større blod vene.
  3. Langsomt trække tilbage nålen ved kanten af ​​åbningen og placer det næsten tangent til den ydre væg af øjeæblet.
  4. Isætningt nålen ind i sub retinale rummet mellem sclera og nethinden.
  5. Sprøjt DNA, indtil du kan visualisere den grønne løsning fylde siden af ​​øjeæblet og skubbe de nethinden indad ved at skabe en bule.
  6. Hvis nålen placering ikke er korrekt, så vil du se DNA-løsning at sprede sig i glaslegemet fylder midten af ​​øjet bolden. Også, hvis du beskadige nethinden for meget, så vil du se DNA-løsningen er på vej ud af øjeæblet.
  7. Langsomt fjernes kanylen, og straks placere elektroderne i parallel inde i ægget efter iblødsætning i PBS. Tryk ned elektroderne til nedsænke ind i den fostervand på en måde, så at den injicerede øjet er placeret mellem elektroderne. Undgå at berøre nogen større blodkar eller hjertet med elektroderne, mens placere dem. Den negative elektrode bør være ved indstiksstedet side, således at DNA kan transporteres fra sub retinal rummet ind i den nethinden hen imod positive elektrode. Electrocorporate nethinden med 5 pulser af 15V til 50 ms med 950 ms intervaller.
  8. Forsigtigt fjerne de elektroderne og forsegle vinduet af ægget med stykker af tydelig scotch tape.
  9. Label og dato injicerede æg, før du sætter den tilbage til kuvøsen. Det tager typisk omkring 3 til 5 minutter at udfylde hele elektroporation processen.
  10. GFP-ekspression kan ses som tidligt som 8 timer efter elektroporering. Du kan dog vente, indtil fosteret har nået den ønskede scene før høst.

3. Repræsentative Resultater

I vores undersøgelse, bruger vi diverse plasmidkonstruktioner at studere reguleringen af ​​genekspression der involverede retinal celleudvikling. I denne video pCAG-GFP (transfektion kontrol) blev anvendt til at følge en succesfuld injektion og elektroporation. Imidlertid, kan enhver plasmid konstruktet med reportergen (GFP, RFP etc.) anvendes. Selvom GFP-ekspression kan ses så tidligt som 8 timer efter electroporation, vi typisk begynde at høste æg på dag 6 (E6) og fremefter. Elektroporerede nethinder blev dissekeret ud af embryonet og analyseret under fluorescerende dissektion mikroskop før indlejring og sektionering. Typisk, kan reportergenet ekspression ses mindste i fjerdedel af nethinden efter en vellykket elektroporering (Fig 1). De transfekterede retinale væv blev yderligere analyseret gennem sektionering for klar visualisering af celle morfologier. Immunhistokemi under anvendelse celle typespecifikke markører (Brn3a, Pax6 etc.) tillod karakterisering af celle-specifik GFP-ekspression (Fig 2).


Figur 1.. Vellykket elektroporering af reporter-plasmid resultater positiv GFP-ekspression. Chicken embryonisk nethinder blev injiceret og elektroporeret ved embryonisk dag 4 og høstet kl embryonisk dag 6.. Mindst 25% af det nethinden blev med held transficeret (A = Top udsigt, B= Bund view). Skala Bar = 1mm.


Figur 2. Karakterisering af GFP udtrykke retinale celler under anvendelse immunohistokemi. GFP-udtrykkende retinale væv på E7 stadium, var faste og sektioneret. Disse sektioner blev derefter farvet med forskellige cellespecifikke markører. Brn3a blev anvendt til at bestemme gangliecellerne (A), mens Pax6 blev anvendt til at bestemme horisontal, amacrine og ganglieceller (B). Skala bar = 50 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målrettet retinal injektion og i ovo elektroporation i embryonale nethinden E4 tidspunkt kan målrette retinale stamceller, hvilket resulterer i evnen til at visualisere alle de seks store nethinden celletyper på enkelt celle niveau. I ovo elektroporation i HH10 (~ E1.5) rettet mod optic vesikel er i stand til transficere celler der udvikler til dannelse øjet. Imidlertid, disse celler have en meget høj omsætning på dette tidspunkt og denne metode er ikke specifik for retinale celler. Det kan være at den høje celle omsætning rate forhindrer opretholdt stabil ekspression. Ved E4, er den embryoet udviklet nok, at de store strukturerne i øjet alle er dannet, men ung nok at flertallet af celler i nethinden er stadig retinale stamceller. Denne metode kan også påføres at vinde / tab af funktionsmutationer undersøgelser, hvor et gen af ​​interesse kan målrettes at studere normal udvikling og / eller sygdom af retina.

Efter at vi blev offentliggjort denne teknik i vorestidligere papir 1, flere forskere på dette område kontaktede os for yderligere bistand på denne teknik. Så vi besluttede at producere denne video for visualisering. Desuden er de fremskridt i vores teknikken beskrevet i denne video.

For at udføre denne teknik med succes, efter kritiske faktorer er værd at beskrive.

Den mest kritiske faktor er at placere nålen præcist i det subretinale rum. For det første må man være omhyggelig med at justere nålen contra-lateral til de vigtigste bundt af blodkar ind i øjet og peger mod næbbet. Denne position er næsten parallelt til hjertet og reducerer chancen for at beskadige hjernen og hjertet. Når piercing gennem vitellinmembranen, sclera, nethinden og glaslegemet, bør nålen ikke rejse langt og trænge igennem enhver blodåre. Hvis nålen er skarpt nok så er denne kan gøres meget nemt med få praksis. Næste skridt er at langsomt at trække tilbage the nål og placer det på kanten af ​​åbningen af ​​nethinden. Der er altid en chance for at trække den helt ud. Hvis det skulle ske, så kan man prøve igen at sætte nålespidsen tilbage ved åbningen. Placering af nålen i subretinarummet (mellem sclera og nethinden) kræver øvelse og tålmodighed. I begyndelsen ser det meget svært, men med lidt øvelse bliver det nemt. Mens injektion af den DNA-opløsningen indersiden det subretinale rum, er det meget vigtigt at observere bule formationen. Bagefter, den grønne løsning starter fyldning omridset af øjet, hvilket indikerer en succesfuld injektion. Hvis opløsningen diffunderer væk eller begynder påfyldning i midten af ​​øjet, der angiver en forkert indsprøjtning hvilket ikke vil give en succesfuld elektroporering.

Den sekunder faktor er den fabrikation af en optimal nål, der er gjort via varme-trækker et glas kapillarrør og bryde den spidsen. Nåle med store spidser har svært ved piercing through den vitellinmembranen hvilket øger chancen for at beskadige nethinden. Normalt skarpeste nålespidser er bedst til dette formål. Dog, nål med meget små tips have svært lastning og levere den DNA'et og have øget chance for at bryde ned inde øjeæblet. Af denne grund laver vi nåle med en spids åbning på omkring 0,1 um i diameter og 20 mm koniske 1. Også, under indlæsning DNA'et blandingen fra en dråbe på et stykke parafilm, er det meget vigtigt ikke at indlæse den sidste bit af væske da det øger chancerne for at få luft inde nålen.

Endelig, placere af elektroderne er meget kritiske for at opnå vellykket elektroporering. De Elektroderne bør placeres parallelt, således at udviklingslandene øjet er beliggende mellem elektroderne. Ekstra forsigtighed skal tages fra at røre nogen større blodkar eller hjertet med elektroderne. Beskadige nogen af ​​disse kan resultere død til embryoet selv efter en vellykket injectipå. Endvidere, de to øjnene er forskelligt orienteret. Det, har den skal holdes i tankerne at ændre den elektroden orientering (positiv vs negativ) således at den negative elektrode bør være altid er på det injektionen side til tillade DNA'et diffunderer ind i de retinale cellerne under den elektriske strøm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og faciliteter Udvalg ved Rutgers University.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke hr. Maaz Enver for brug af hans HD-kamera (Cannon VIXIA HFS100). Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra NIH (EY018738), New Jersey Kommissionen om Spinal Cord Forskning (08 til 3074-SCR-E-0 og 10 til 3091-SCR-E-0), og Busch Biomedical Research Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs Sunrise Farms (Catskill, NY)
Chicken egg incubator GQF Manufacturing Model-1550 Set to 60% humidity and 37.5°C.
Glass capillary tubes World Precision Instruments, Inc. TW150F-4
0.1 ml syringe Hamilton Co Gastight 1710 Alternatively 1ml syringe can be used as well
Masterflex Silicone (peroxide) Tubing Cole-Parmer HV-96400-13 Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe
Tweezers Dumont AA
Micromanipulator World Precision Instruments, Inc. M3301-M3
Plasmid DNA pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Dilute it to 0.025 % with PBS
Pulse generator Harvard Apparatus BTX ECM 830 Square wave generator
Electrodes Harvard Apparatus BTX model 514 Our electrodes were spaced 3-5 mm apart
Monochrome Digital Camera Carl Zeiss, Inc. Axiocam MRM
Fluorescent Dissection Microscope Leica Microsystems Leica MZ16FA
Upright Fluorescence Microscope Carl Zeiss, Inc. Zeiss Axio Imager A1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
  2. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
  3. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
  4. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
  5. Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).

Comments

1 Comment

  1. Hi
    Do you think it would be possible to perform this teqnique on much older embryos, in ovo?
    How do you confirm that the injection was in place?

    Reply
    Posted by: Yael K.
    January 7, 2013 - 6:38 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics