Author Produced

Analyse van de Single-cell gentranscriptie door RNA TL

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fluorescerende

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hechting van Plasmodium falciparum geïnfecteerde erythrocyten (IE) om humane endotheliale receptoren tijdens malariabesmettingen wordt gemedieerd door expressie van PfEMP1 eiwitvarianten gecodeerd door de genen var.

De haploïde P. falciparum genoom herbergt ongeveer 60 verschillende var genen waarvan slechts een is verondersteld te transcriberen per cel tegelijk in het bloed stadium van de infectie. Hoe dergelijke elkaar uitsluitende regulatie van var gentranscriptie wordt bereikt is onduidelijk, evenals de identificatie van de individuele var genen of subgroepen van var genen geassocieerd met verschillende receptoren en het gevolg van differentiële bindend zijn voor de klinische uitkomst van P. falciparum infecties. Onlangs heeft de transcriptie elkaar uitsluitende paradigma is in twijfel getrokken door transcriptie assays gebaseerd op individuele P. falciparum transcript identificatie in enkele infected erytrocytaire cellen met behulp van RNA fluorescente in situ hybridisatie (FISH) analyse van var gentranscriptie door de parasiet in individuele kernen van P. falciparum IE 1.

Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van de RNA-FISH methode voor de analyse van var gentranscriptie in enkele kernen van P. falciparum geïnfecteerde humane erythrocyten. De methode is gebaseerd op het gebruik van digoxigenine en biotine-gelabelde antisense RNA probes met de TSA Plus Fluorescence Palette System 2 (Perkin Elmer), microscopische analyse en vers geselecteerd P. falciparum IE. De in situ hybridisatie methode kan worden gebruikt om transcriptie en regulering van een aantal genen die tijdens de verschillende fasen van het P. toezicht falciparum levenscyclus en is aanpasbaar aan andere malariaparasiet soorten en andere organismen en celtypes.

Protocol

1. Generatie van Vers Geselecteerde geïnfecteerde erythrocyten

Voor deze test worden de beste resultaten verkregen met vers geselecteerde cultures voor oppervlakte-expressie van PfEMP1 eiwit. In dit experiment de 3D7 P. falciparum lineage is geselecteerd met specifieke antilichamen zoals eerder beschreven 1.

Dag 1

  1. Oogst 200 ul gepakte bloedcellen van een P. falciparum cultuur met 2-5% late stadium IE door centrifugeren bij 800 g gedurende 8 min bij kamertemperatuur.
  2. Het bloed pellet resuspendeer in 2 ml van 37 ° C warm 0,75% gelatine-oplossing in een 14 ml steriele buis en gedurende 15-20 min bij 37 ° C laat de geïnfecteerde en ring-stadium IE het sediment mogelijk.
  3. Oogst de late-fase IE, dwz de bovenste fase, in een nieuwe 14 ml tube en was tweemaal met 10 ml van 37 ° C warm RBC-wash media.
  4. Verdun 50 pi specifieke anti-PfEMP1-antilichamen in 2 ml van 37 ° C warm RBC-wasmedia en steriele filter.
  5. Meng de gewassen laat stadium IE met het gesteriliseerde verdunde antisera in een 14 ml steriele buis en incubeer 30 min bij 37 ° C onder zacht schudden.
  6. Spin down bij 800 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur, en was tweemaal met 10 ml van 37 ° C warm RBC-wasmedia.
  7. Wassen 50 ul Proteïne A Dynabead suspensie tweemaal met RBC-wasmedia met een DynaMaq-15 magneet.
  8. Resuspendeer de Dynabeads in 300 ul RBC-wash media en voeg ze toe aan de gewassen in een laat stadium IE. Incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C onder zacht schudden.
  9. Breng de buis aan de DynaMaq-15 magneet. Laat gedurende 1-2 minuten en verwijder al het vocht.
  10. Resuspendeer de Dynabeads in 4-5 ml RBC-wash media. Breng de buis terug naar de magneet en laat het 1-2 min voor het verwijderen van alle vloeistof. Herhaal deze wasstap.
  11. Breng de gewassen kralen aan een 25 cm 2 steriele cultuur fLask met 200 ul vers verpakte rode bloedcellen. Voeg 5 tot 6 ml Albumax media in de cultuur. Bewaar nacht bij 5% CO2 bij 37 ° C.

Dag 2

  1. Verwijder de Dynabeads uit de cultuur als de geselecteerde IE heeft het verse rode bloedcellen reinvaded door al de cultuur om een ​​14 ml steriele buis. Zet de tube op de DynaMaq-15 magneet en laat 1-2 minuten. Vervolgens giet al het vocht terug naar een cultuur kolf.
  2. Cultuur voor zo weinig cycli als mogelijk tot een parasitemie van 5-10% en parasieten zijn bij de ringstage.
  3. IE moet worden geanalyseerd door FACS om ervoor te zorgen dat de juiste oppervlakte fenotype, dat wil zeggen eiwitexpressie van een van beide PFD1235w and/orPF11_0008 is een verkregen.

2. Bereiding van Probes

De antisense RNA probes werden gegenereerd uit de variabele gebieden van de PFD1235w en PF11_0008 var </ Em> genen van P. falciparum 3D7 genomisch DNA. DNA werd geamplificeerd door PCR en gekloneerd in de vector pSPT18 of 19 voor transcriptie, respectievelijk volgens de door de fabrikant (Roche). De probes (580 baseparen (bp) en 590 bp in lengte) worden gemerkt met digoxigenine (DIG) of biotine met een DIG RNA labeling Kit of Biotin RNA labeling Mix respectievelijk. We bevestigden de specificiteit van de probes zowel Northern blot analyses en enkelvoudige FISH analyse 1.

3. Dunne Smear en fixatie van parasieten Voorafgaand aan in situ hybridisatie

Dag 1

Alle stappen worden uitgevoerd in een RNase-vrije omgeving en de reagentia RNase-vrij of voorbehandeld met diethylpyrocarbonaat (DEPC) of RNase Zap (Invitrogen). De dia's en dekglaasjes moet worden gereinigd met alcohol om de resterende productie-vet te verwijderen. Het is belangrijk om het protocol te voeren zonder pauze tussen de stappenom het risico van verontreiniging te minimaliseren nuclease.

  1. Maak een dunne bloed film van de standaard verspreiden methode 3. Met behulp van de 100x olie objectief van de microscoop, de telling van de IE en bereken het percentage van IE in de cultuur. Controleer of de parasiet stadia zijn bij benadering synchroon in de ring en vroege stadia van de trofozoiet IE cyclus. Dit zijn de pre-replicatie, uni-kiemen fasen expressie var gen mRNA en geschikt voor cel transcriptie FISH assays van dit type.
  2. Breng 50 pl van de parasiet cultuur op parasitemie van 5-10%, met een 1,5 ml RNase-vrij Eppendorf buis. Centrifugeer gedurende 1 min bij 2.000 rpm bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder de media en voeg 50 ul PBS pH 7,2 in DEPC-behandeld water. Voorzichtig Schud de buis. Tweemaal herhalen centrifugale sedimentatie stap om de cellen vrij van media en celresten wassen.
  4. Maak vier goede kwaliteit dunne strepen. Voor elke uitstrijkje, maak een uitstrijkje opeen diameter van 11 mm en een 4 goed glijbaan, dat wil zeggen vier glazen dia's in totaal, in een RNase-vrij kap (een kritische stap). Golf glijdt kort in de lucht te drogen. Maak drie extra geleiders voor negatieve controles een dia-sonde kleuring voor andere irrelevante gen met een bepaalde probe, een glijbaan voor RNase behandeling en een derde dia met IE niet het gen van belang. Laat de dia's om op de bank te drogen gedurende 10-20 minuten.
  5. Bevestig de dunne films door 60 pi fixatie oplossing die 4% paraformaldehyde en 5% ijsazijn in de putjes. Laat 10 min op de bank bij kamertemperatuur.
  6. Was de dia's in 2x SSPE buffer gedurende 5 min door voorzichtig schudden bij kamertemperatuur. Kort te verwijderen overtollige vloeistof door het aanraken van de putjes die de cellen voorzichtig met een papieren zakdoek.
  7. Bedek de slides met 0,01% pepsine in 0,01 M HCl gedurende 2 minuten bij 37 ° C (een kritieke stap). Was de dia's in 2x SSPE gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  8. Verdun de RNase oplossing tot een eindconcentratie van 10 ug / ml. Het negatieve controle uitstrijkjes met 60 ul van de RNase oplossing. Incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C en vervolgens het wassen van de objectglaasjes in 2x SSPE gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  9. Zich onmiddellijk de hybridisatiestap.

4. Hybridisatie van RNA probes aan de gefixeerde glaasjes

Dag 1

  1. Bereid de hybridisatie kamer, zoals een ThermoStar 100 HC4 of een lege pipet tip box in een schone oven, door te besproeien met RNase Zap en af ​​te vegen schoon met een papieren zakdoek. Vul de kanalen van de hybridisatie kamer of de bodem van de doos met DEPC behandeld water te zorgen dat de dia niet uitdrogen tijdens hybridisatie. Sluit de tank af en verwarm tot 48 ° C.
  2. Verdun de probes in de hybridisatie-oplossing tot een eindconcentratie van 12 ng / pl. Denaturatie van de probe-oplossing bij 65 ° C gedurende 5 min in een verwarmingsblok. Onmiddellijk koelen op ijs.
  3. Kort aan de lucht drogen de dia's na de 2x SSPE wassen. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof rond de putten met een papieren zakdoek.
  4. Open de hybridisatie kamer en plaats de dia's in de kamer. Een of beide probes in een totaal volume van 60 ul per putje. Voorzichtig dekking van de vloeistof druppel met een RNase-vrij dekglas met behulp van steriele pincet.
  5. Sluit de tank en de dia hybridiseren bij 48 ° C gedurende ten minste 16 uur 's nachts.

5. Antilichaam Vervoeging en Fluorescentie Amplification

Dag 2

De volgende stappen zijn gebaseerd op de TSA Plus System Fluorescence Palette van Perkin Elmer. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

  1. Was de dia 3 keer in TNT buffer gedurende 5 minuten onder zacht schudden.
  2. Blokkeren putjes in 150 ul TNB buffer gedurende 30 min.
  3. Verdun het HRP-geconjugeerd α-DIG antilichaam in TNB buffer bij een verhouding van 1:100 en het HRP-geconjugeerd α-biotine antilichaam in TNB buffer, in een verhouding van 1:500. Verwijder overtollig TNB buffer van de dia's met een papieren zakdoek. Bij het detecteren van gelijktijdig twee transcripten, kunnen beide antilichamen meteen gaan. Breng een totale hoeveelheid van 100 ui van het antilichaam-TNB oplossing per putje en zorgvuldig bedekken met een dekglas. Incubeer de glaasjes gedurende 2 uur.
  4. Verwijder de dekglaasjes. Was de dia's in TNT buffer 3 keer gedurende 5 minuten.
  5. Verdunnen FITC-fluorofoor in de tyramide versterkingsreagens in een verhouding van 1:500 en breng 100 ui van de oplossing aan elk putje. Bedek de putten met dekglaasjes en incubeer gedurende 12 minuten.
  6. Verwijder de dekglaasjes en was de dia's 3 keer gedurende 5 minuten in TNT buffer door voorzichtig schudden.
  7. Verdunnen Cyan3-fluorofoor in de tyramide versterkingsreagens in een verhouding van 1:500. Voeg 100 pl peren van deze oplossing. Bedek de putten met dekglaasjes en incubeer gedurende 12 minuten.
  8. Verwijder het deksel glijdt zorgvuldig en vervolgens snel spoel de glaasjes door onderdompeling in TNT buffer.
  9. Was de dia 3 keer met TNT buffer gedurende 5 minuten.
  10. Quickly dompel de dia's in DEPC-behandeld water.
  11. Laat de dia's aan de lucht drogen. Monteer de dia's met anti-fade reagens dat DAPI. Sluit de hoeken van de dekglaasjes met nagellak.
  12. De dia's zijn nu klaar voor microscopie. Houd de glaasjes afgedekt met aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C indien het experiment moet worden ingevuld de volgende dag. Een volledige afdichting van de zijden van de schuiven kan worden uitgevoerd 24 uur na het aanbrengen van de anti-fade reagens. Hierdoor kan de dia te beelden tot een week na de protocol is voltooid.

6. Visualisatie van gehybridiseerd Probes

  1. Zet de microscoop. Een standaard immunofluorescentie microscoop is sufficient voor dit soort experiment, maar als je toegang hebt tot een confocale microscoop kunt u ook gebruiken voor 3D-beelden of om video's van je gekleurde cellen te verkrijgen. Laat microscoop op te warmen voor 15-30 min. Schakel de computer en de software.
  2. De kwaliteit van de vlekken op de immunofluorescentie microscoop. Kies een plek met een paar parasieten.
  3. Handmatig de winst van elke laser. Stel de pixelverblijftijd van 4-6 m -1 s -1 en de stappen tot 512 x 512 pixels.
  4. Neem een ​​testfoto met behulp van Frame Lambda. Stel de laser te krijgen.
  5. Neem een ​​minimum van 20 goede foto's van fluorescerende enkele cellen. Tenminste 2-5 beelden van een veld met 5-20 parasieten nodig zijn een waarheidsgetrouw overzicht van het percentage positieve parasieten verkrijgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont een stroomschema van de belangrijkste stappen en de tijdsduur van de RNA FISH methode.

Een reeks van representatieve beelden van goed en slecht bewaard gebleven gebrandschilderde mRNA FISH experimenten met behulp van enkele P. falciparum IE worden getoond in Figuur 2. Deze intracellulaire protozoaire heeft een klein (1-1,5 micrometer diameter) kern, die is blauw gekleurd met DAPI. Vierentwintig uur na erytrocyten invasie in P. falciparum het proces van schizogony, dat wil zeggen kerndeling, begint. Optimale FISH detectie van var gentranscriptie optreedt op ongeveer 10-22 uur in deze 48 uur intra-erytrocytaire lytische cyclus. Probes hybridiseren algemeen soorten die lijken naast het belangrijkste nucleaire lichaam, wat waarschijnlijk nucleaire envelop-geassocieerde endoplasmatisch reticulum mRNA. De beelden van goede kwaliteit in rij A toon-FITC (groen) en Cyan3-(rood) gelabelde probes overeenkomt met de PFD1235w en PF11_0008 var genen, respectievelijk in de twee geselecteerde P. falciparum subactielijn, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-lokalisatie van de genen blijkt maar niet absoluut. Rij B toont slechte hybridisatie van beide sondes aan parasieten die hebben ofwel afgebroken of grotendeels opgehouden transcriberen var mRNA. In rij C, is een goede FISH hybridisatie verkregen, maar de cellulaire behoud slecht is, zoals blijkt uit slecht te verspreiden en aggregeren van parasieten.

Figuur 1
Figuur 1. RNA FISH experiment stroomdiagram. Het stroomschema illustreert de belangrijkste punten en de timing van de FISH-procedure.

Figuur 2
Figuur 2. Confocale beelden van RNA-FISH in dubbele geselecteerd P. falciparum aangeeft simultane mRNA transcriptie van twee verschillende genen var gelabeld met FITC ofwel (groen) of Cyan3 (rood) signaal. DAPI kleuring (blauw) geeft de parasiet nucleair DNA. De verticale rij a1, b1 en c1 tonen de transmissie beelden van de parasieten. Schaal bar 5 urn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNA FISH analyse, in tegenstelling tot werkwijzen zoals Northern blotting en RT-PCR, maakt onderscheid specifieke mRNA transcripten in de enkele cel. Dit maakt het mogelijk onderscheid te maken tussen transcriptioneel actieve en inactieve cellen, in dit voorbeeld, P. falciparum parasitaire protozoa in menselijke rode bloedcellen. Dergelijke whole-cell waarnemingen zijn vaak nodig en kunnen ontrafelen belangrijke en nieuwe transcriptionele patronen 1.

Hoewel andere RNA FISH werkwijzen beschreven 4-10, is er een behoefte aan de ontwikkeling van een nieuwe en verfijnde protocol voor de studie van gelijktijdige var mRNA transcriptie in P. falciparum. Met asRNA probes als detectieapparatuur, kan de speciale-temporele patronen van mRNA activiteit gemakkelijk worden gelokaliseerd in de cellen. Daarnaast kan asRNA probes ook in andere experimentele systemen die hun specificiteit 1 zou ondersteunen. Andere critsche parameters die van belang zijn bij het ontwikkelen van een nieuw protocol omvat fixatie en permeabilzation van de cellen. Deze stappen werden empirisch vastgesteld door het testen van verschillende chemische reagentia zoals door andere auteurs 5. Wij concludeerden dat het combineren van de langzaam werkende verknoper paraformaldehyde samen met het fixeermiddel coagulant azijnzuur we een goed behoud van de weefselmorfologie verkrijgen. Daarnaast bleek dat het blokkeren van de pre-cellen voordat het toevoegen van de probes niet nodig was, net als andere RNA beschreven FISH protocollen 5. Bovendien is in de onderhavige protocol gebruiken we zachte wassingen een mild protease (pepsine) met lage hoeveelheden en een korte incubatieperiode om de probe en de antilichamen te diffunderen in de kern en hybridiseren met het mRNA bevestigd aan de ER, minimaliseren schade aan omliggende membranen (fig. 2a1-2A4).

Bovendien het RNA FISH en de hoge resolutie beelden gegenereerd door de camerA bij de confocale microscoop blijkt of een bepaalde cel is positief voor kleuring of niet en geeft ook waardevolle informatie over de ruimtelijke relaties tussen de gekleurde antisense RNA en DAPI gekleurde kern. Als opgelost in de afbeeldingen in figuur 2A4, de mRNA blijkt naast de kern worden verbonden, waarschijnlijk in het endoplasmatisch reticulum, en niet bovenop, zoals verwacht in een DNA-vissen 11-12.

Studies van afzonderlijke cellen vereisen opmerkingen van talrijke parasieten en op verschillende tijdstippen om een ​​statistisch significant resultaat. Zo RNA FISH analyse is een nogal tijdrovend techniek die geduld en veel trial-and-error experimenten vraagt ​​het kalibreren van de techniek. Zoals RNA FISH is een techniek van de vele parameters een trouble-shooting gids voor de belangrijkste stappen van dit protocol zijn weergegeven in tabel 1.

Probleem Mogelijke cause Aanbeveling
Zwak of geen signaal
  • Low-mRNA-expressie.
  • mRNA degradatie.
  • Probe wordt afgebroken, in-efficiënt gemerkte of te laag in concentratie.
  • Te hoge hybridisatietemperatuur.
  • Lang pepsine behandeling.
  • Cellen worden niet genoeg gepermeabiliseerde.
  • Controleer de eiwitexpressie door FACS.
  • Werken onder RNAse vrije omstandigheden en gebruik alleen vers bereide oplossingen.
  • Doe een kwaliteitscontrole van de gemerkte probe op gel en vergelijken met een gelabeld RNA control. Een titratiereeks van de probeconcentratie in FISH.
  • Verlaag de hybridisatie temperatuur stapsgewijs.
  • Verminder de pepsine behandeling lengte.
  • Verleng de pepsine treatment lengte of probeer een andere reinigingsmiddel.
Slechte mobiele behoud
  • Een te hoge parasitemie of gestrest parasieten.
  • Te dikke lagen.
  • Slecht schoongemaakt dia's.
  • De cellen op de dia's worden deattached.
  • Gebruik een gezonde parasiet cultuur door het houden van de parasitemie minder dan 10% en het veranderen van de cel media elke dag.
  • Verdun de parasiet cultuur.
  • Maak de dia's met alcohol en wacht ten minste 10 minuten voor de dia's te drogen.
  • Gebruik vers bereide para-formaldehyde en / of verhoging van de paraformaldehyde incubatie lengte.
High Achtergrond
  • Te hoge probe concentratie.
  • Onvoldoende wassen vanparasieten.
  • Barsten shizonts.
  • Onvoldoende na hybridisatie wasbeurten.
  • Het blokkeren van buffer wordt verontreinigd of inefficiënt.
  • Een titratiereeks van de probeconcentratie in FISH.
  • Was tweemaal de parasieten voor de voorbereiding van de dunne films.
  • Synchroniseer de cultuur strakker.
  • Het aantal en / of lengte wasbeurten.
  • Bereid nieuwe blokkeerbuffer. Probeer andere blokkerend reagens, concentratie of verlenging van de blokkeringsperiode
De RNase behandelde controlegroep positief
  • De oplossing Rnase inactief.
  • Te lage RNase concentratie.
  • De incubatietijd was te kort.
  • Bereid een nieuwe Rnase oplossingtie.
  • Verhoog de concentratie. Maak een titratie serie.
  • Verleng de RNAse behandelingsperiode.
Vals-positieve detectie van negatieve controle parasieten
  • De probe is niet specifiek.
  • Parasieten drukken niet de mRNA gedetecteerd door de probe.
  • Controleer de specificiteit van de sondes.
  • Controleer of de gebruikte parasiet lijn de juiste is en vers geselecteerd.

Tabel 1. Troobleshooting begeleiding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Michael Alifrangis en Ulla Abildtrup bedanken voor genotypering van parasieten en Christina Holm voor een uitstekende technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door Howard Hughes Medical Institute (subsidie ​​55005511), De Lundbeck Foundation (subsidie ​​R9-A840) en door het Niels Bohr Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
  2. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  3. Cheeseborough, M. District Laboratory Practice in Tropical Countries. Cambridge University Press. Cambridge. (2006).
  4. Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites. Genome Biol. 10, R117 (2009).
  5. Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum. RNA. 15, 116-127 (2009).
  6. Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites. Cell. 121, 25-36 (2005).
  7. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).
  8. Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin. J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).
  9. Thompson, J., Sinden, R. E. In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei. Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).
  10. Thompson, J. In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites. Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).
  11. Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony. Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).
  12. Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics