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Transplante hepático ortotópico experimental em ratos

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Summary

Nós apresentamos uma revisão fácil de estabelecer a técnica de dois manguito clássica para transplante hepático em ratos.

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Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic Liver Transplantation in Rats. J. Vis. Exp. (65), e4143, doi:10.3791/4143 (2012).

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Abstract

Progresso clínico no campo de transplante de fígado tem sido largamente suportado por 1,2 modelos animais. Desde a publicação do transplante hepático primeiro rato em 1979 por Kamada et al. 3, este modelo permanece o padrão ouro apesar de várias propostas de técnicas alternativas 4. No entanto, sua maior utilização é limitada pela sua curva de aprendizagem 5.

Neste trabalho de vídeo, vamos mostrar uma revisão simples e fácil de estabelecer de técnica Kamada de dois manguito. A veia cava supra-hepática anastomose é realizada manualmente com uma sutura contínua, ea porta cava e anastomoses infrahepatic veia cava são realizados utilizando um sistema de manguito rápida linker 6. Fabricar o kit rápido-ligante é mostrado em um papel de vídeo separada.

Protocol

1. Operação doador

  1. Anestesiar ratos machos, pesando 200 ± 20 gramas, com isoflurano em cone máscara (3% para a indução, 2% durante a operação, um fluxo de ar l / min, FiO2 70%).
  2. Realize uma laparotomia mediana e grande transversal e cauterização dos vasos epigástricos em ambos os lados.
  3. Cortar o ligamento falciforme, e separar a veia esquerdo do diafragma a partir da veia cava suprehepatic. Finalmente, dividir a veia do diafragma entre duas ligaduras de seda 7-0.
  4. Corte o triangular esquerdo e os ligamentos gastro-hepáticas.
  5. Divida o ligamento hepato-esofágico e artéria entre 7-0 ligaduras (coagulação é uma alternativa válida).
  6. Isolar o infrahepatic veia cava para baixo para a veia renal esquerda. Separa-se a veia renal direita a partir dos tecidos circundantes e dividi-lo entre um 10-0 e uma ligadura 7-0, nas suas extremidades proximal e distai, respectivamente.
  7. Divida a veia supra-renal direita entre 7-0 ligatures e livre o fígado de seus ligamentos posteriores cortando sob leve tração.
  8. Isolar a veia gastroesplênico e dividi-lo entre um 10-0 e uma ligadura 7-0, nas suas extremidades proximal e distai, respectivamente.
  9. Divida a artéria hepática própria entre 7-0 laços.
  10. Isolar a veia duodeno pâncreas e dividiu-a entre um 10-0 e uma ligadura 7-0, em sua extremidade proximal e distal, respectivamente.
  11. Insira um 22G, 3,5 mm de stent no ducto biliar comum através da prática de uma pequena incisão de 1 cm de distância a partir do hilo hepático. Fixe o stent em posição com uma ligadura 7-0.
  12. Injectar 10 UI de heparina, diluiu-se em 1 ml de solução salina normal, através da veia dorsal do pénis.
  13. Canular a porta cava (tanto quanto possível a partir do hilo) com uma agulha de 21G e suavemente lavar o fígado com 20 ml de lactato de Ringer frio (ou outras soluções de conservação). Ao mesmo tempo, cortar a veia cava inferior das veias renais para permitir uma adequada outflow. Perfusão de fígado frio deve durar entre um e dois minutos.
  14. Corte a porta abaixo da veia cava duodeno pâncreas.
  15. Corte o duto biliar comum distal à ligadura ao redor do stent.
  16. Complete a incisão da veia cava infrahepatic.
  17. Cortar o supra-hepática da veia cava desnatado para o diafragma e remover o fígado.
  18. Coloque o fígado em uma bacia cheia de ringer lactato fria e colocar a bacia em uma almofada de gelo.

2. Preparação do Enxerto

  1. Insira o porta veia em seu punho, então everter o navio ao redor da borda para expor a íntima. Fixe o segmento evertido no punho com uma ligadura de 7-0.
  2. Repita a mesma operação no infrahepatic veia cava.
  3. Posicionar uma braçadeira de micro-(4-6 mm de comprimento) na parte proximal do infrahepatic veia cava. Esta operação evita a perda de sangue após a reperfusão do portal.
  4. Derrubar o fígado e inserir duas prolene 8-0 suturasnas bordas opostas laterais da supra-hepática da veia cava, de fora para dentro.
  5. Guarde o enxerto (imersos em solução de ringer lactato) na geladeira a 0-4 ° C.

3. Operação destinatário

  1. Anestesiar ratos machos, pesando 200 ± 20 gramas, com isoflurano em cone máscara (3% para a indução, 2% durante a operação, um fluxo de ar l / min, FiO2 70%) e manter em uma almofada de aquecimento. De nota, pesos receptores e os doadores devem ser combinados (± 40 gramas).
  2. Injectar 10 ml de soro fisiológico por via subcutânea e 0,03 g de piperacilina / tazobactam intramuscular antes da laparotomia.
  3. Realize uma laparotomia xipho-púbica na linha média.
  4. Inverter o processo xifóide com uma pinça de auto-estáticas, a fim de melhor expor o fígado.
  5. Corte os ligamentos anterior e dividir a veia diafragmática esquerda entre dois laços 7-0.
  6. Divida o ligamento hepato-esofágico e artéria entre 7-0 ligaduras (coagulation é uma alternativa válida). Não é mostrado no vídeo (idêntica à operação de dador).
  7. Isolar o infrahepatic veia cava até a veia renal direita.
  8. Dividir a veia supra-renal direita entre 7-0 ligaduras e fígado o livre a partir dos seus ligamentos posteriores cortando sob uma ligeira tracção (não mostrado no vídeo (idêntica à operação de dador)).
  9. Coloque uma ligadura 7-0 ao redor do ducto biliar comum, logo abaixo de sua divisão. Dito de outra ligadura um milímetro abaixo e cortar no meio.
  10. Isolar a artéria hepática no hilo e dividi-lo entre 7-0 ligaduras.
  11. Gentilmente separar ramos portais direito e esquerdo. Preste atenção para não danificar a artéria hepática comum ou a veia gastro-esplênica.
  12. Posicione o anel ao redor da cava da veia cava, cranialmente até a veia renal direita. Em seguida, fixar a parede do vaso para o anel através da colocação de quatro cardinais 9-0 suturas.
  13. Repita a mesma operação com o anel de portal na porta cava. Injectar 10 UI de heparina, diluiu-se em 1 ml de solução salina normal, através da veia dorsal do pénis.
  14. Definir a anestesia em 0,25% ea FiO2 em 100%.
  15. Prenda o infrahepatic veia cava logo acima da veia renal direita, em seguida, apertar a veia porta logo acima da veia gastro-esplênica. Finalmente prender o supra-hepática da veia cava não se esquecendo de incluir pelo menos 2 mm do diafragma.
  16. Corte o supra-hepática da veia cava próxima ao parênquima.
  17. Corte a esquerda e os ramos direito do portal e dividir o septo entre os dois.
  18. Corte o infrahepatic veia cava próximo ao parênquima, prestando atenção para não incisar qualquer dos pontos previamente posicionados. Remover o fígado e colocar o enxerto para dentro da cavidade abdominal.
  19. Realizar uma anastomose ponta a ponta entre a cava supra-hepática veia do enxerto e do receptor. Comece com a sutura da parede posterior da esquerda para a direita, em seguida, proceder na parede anterior da direita para a leManter o pé de sutura anterior solto até ao fim, a fim de permitir que um rubor generosa do lúmen interior antes de apertar as extremidades.
  20. Insira o ramo caudal da aproximador no punho anel portal, em seguida, insira o porta cava do enxerto na fenda do ramo cranial da aproximador, com a braçadeira portal encontrar sua posição no slot.
  21. Feche o aproximador durante a lavagem do destinatário veia porta com solução salina normal e permitir que a braçadeira para inserir dentro do vaso. Fixe o destinatário da veia porta em torno de seu punho com um empate 7-0 circunferencial.
  22. Remover o aproximador. Abra o grampo na veia cava supra-hepática ea veia porta em ordem: fluxo portal está restabelecida.
  23. Retire o anel portal cortando as ligaduras 9-0 com extra-finas tesoura.
  24. Inserir o ramo caudal do aproximador no punho anel cava; então inserir o infrahepatic veia cava do enxerto na fenda do crânio ramo da aproximador, com a braçadeira cava encontrar sua posição no slot.
  25. Feche o aproximador durante a lavagem do destinatário infrahepatic veia cava com solução salina normal e permitir que a braçadeira para inserir dentro do vaso. Fixe o destinatário da veia cava em torno de seu punho com um empate 7-0 circunferencial.
  26. Remover o aproximador. Abra as microclamps no infrahepatic veia cava do enxerto e do receptor em ordem: fluxo venoso está agora restabelecida.
  27. Realizar uma incisão parcial do ducto do destinatário biliar comum, aplique uma leve tração para a cabeça, e insira o lado livre do stent previamente inserido no ducto biliar do enxerto. Fixe o stent com um empate 7-0 circunferencial.
  28. Feche o animal por camadas com 5-0. Permitir que a água livre e comida de despertar.
  29. Administrar analgesia eficaz de acordo com protocolos institucionais locais. Uma duração mínima de 24 h é recomendada.
> _content "Digno de nota: fim-de-final da anastomose da artéria hepática pode ser realizada, quando exigido pelo projeto experimental (a artéria não é necessário para a sobrevivência a longo prazo após o transplante de fígado de rato).

4. Os resultados representativos

A técnica descrita pode ser dominado com sucesso pela nossa equipe após cerca de 10 cirurgias de treinamento. Ele permitiu que 100% sobrevivência a longo prazo (> 21 dias) em 36 consecutivo Lewis-a-Lewis e Agouti-a-Lewis Trevas transplantes, após o período de formação de curta duração (um número de receptores de enxertos singênicos fígado foram mantidos vivos por mais de 12 meses agora). Pós-transplante singénicos dia 1 testes de função hepática mostrou aspartato transaminase mediana (AST): 84 U / l (51,7-92,7) alanina transaminase e mediana (ALT): 172,5 U / l (127,5-240,2). A fase anepática média (de veia porta de fixação de enxerto re-perfusão) foi de 14 ± 2 min, com o maior passo de ser o supra-hepática da veia cava anastomose (executando suture) tempo de 9 ± 2 min.

O sistema quick-linker permitiu o posicionamento de 1,55 mm de calibre algemas em veia porta e 2,40 mm de calibre punhos na veia cava (destinatários pesando 200 ± 20 g). Em contraste, quando tentámos transplante utilizando a técnica de Kamada, eles não podia exceder 1,40 milímetros e 2,16 milímetros, respectivamente (ratos correspondentes para a estirpe e peso). Como mostrado na Figura 7, rápido-linker anéis são concebidos para manter os vasos receptoras sobre óptima alongamento, permitindo paquímetro mínimo e desperdício de comprimento, o que resulta em mais perto-a-fisiológicas resultados hemodinâmicos.

A Figura 1
Figura 1. Medidas anéis.

A Figura 2
Figura 2. Medidas Microclamps.

A Figura 3
Figura 3. Quick-linker kit.

A Figura 4
Figura 4. Quick-linker armado.

A Figura 5
Figura 5. Quick-linker fechado.

A Figura 6
Figura 6. Braçadeira SHVC.

A Figura 7
Figura 7. Clássico contra quick-linker assistidas manguito anastomose-hemodinâmica.

A Figura 8
Figura 8. Doadores e preparação destinatário pele e incisão.

Discussion

O presente modelo de transplante de fígado de rato pode ser facilmente estabelecida. Em nossa experiência, alguns pontos-chave ajudar a minimizar o risco de morte (≤ 20%). Mortes precoces, que ocorrem dentro das primeiras três horas de reperfusão, são mais frequentemente devido a um enfarte do intestino, como consequência de um portal longo de aperto. Portanto, é recomendável para manter a fase anepática dentro do limite ideal de 15 minutos (20 minutos ainda aceitável). Central embolia aérea também pode ser uma causa de morte súbita e é obrigatório para descarregar todas as veias antes da anastomose.

Óbitos ocorridos entre o dia pós-operatório um e três são muitas vezes devido à insuficiência hepática ou trombose da veia cava. Deve-se, portanto, evitar qualquer enxerto agressivo de lavagem antes do explante no doador (que lavar com 20 ml durante aproximadamente 60 segundos) e garantir uma adequada preservação frio (imersão total em 0-4 ° C solução ringer lactato). O risco de trombosepode ser diminuída através da minimização da manipulação da íntima e preservar a sua integridade. Nós não recomendamos o uso de anticoagulação após a cirurgia.

As mortes entre o dia pós-operatório de quatro e nove estão muitas vezes relacionados com colangite bacteriana 7. Com base na nossa experiência, uma dose única de piperacilline / tazobactam (0,03 g) administrado antes da laparotomia é suficiente para minimizar o risco de infecção biliar comum.

A morte é um evento raro após o dia 10. No entanto, devido à ausência de fluxo arterial, alguns problemas de condutas biliares pode ser observado com cholastasis 8. Dependendo das necessidades do investigador uma arterialização pode ser considerado 9. Digno de nota, um tempo de isquemia fria até 24 horas pode ser considerado como 10 aceitável.

O sistema quick-linker foi originalmente concebido para realizar transplantes de fígado com três anastomoses manguito (fase anepática muito curto). No entanto, o te três bainha-condutahaver descrição prévia requer o uso de pinças muito pequenas para a cava supra-hepática veia braçadeira (SHVC) e não tem sido largamente aceite, devido ao risco de problemas de fígado de saída 11-14. Nós, portanto, a favor de uma rápida linker técnica de três manguito assistida somente quando os tempos de isquemia quente com menos de dez minutos são necessários. Na maioria dos estudos no entanto, as fases de implantação até 15-18 minutos são aceitáveis, permitindo a utilização da técnica de dois bainha-conduta, e uma drenagem mais fisiológico SHVC. Como mostrado neste papel de vídeo, que rotineiramente usar o sistema rápido-ligante na segunda parte da implantação só. Embora algum tempo extra cirúrgico é necessário para posicionar as alças rápido-ligante, esta parte do processo está associado com riscos mínimos e permite a um encurtamento das graças anepática fase crítica para inserções mais fáceis golas. Outras vantagens do sistema rápido-ligante são um melhor alinhamento vaso enxerto-receptor e da utilização de punhos mais largos, com melhores resultados hemodinâmicos em comparação com otécnicas anteriormente descritas (incluindo a descrita por Kamada et ai.) 6 (Fig. 7).

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

CT foi apoiada pela National Science Foundation suíço (SCORE concessão 3232230-126233). O estudo foi financiado pela Fundação Artères, a Astellas Foundation Europe e da Fundação Boninchi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tool / Reagent Company Catalogue n. Comment
Portal cuff altecweb.com or smiths-medical.com Coil 01-96-1729 800/100/420 Bore : 1.55mm
Wall : 0.30mm
Length: 3.5 mm
Infrahepatic v. cava cuff altecweb.com or smiths-medical.com Coil 01-96-1733 800/100/540 Bore : 2.40mm
Wall : 0.30mm
Length: 3.5 mm
Common bile duct stent common 22G venflon    
7-0 silk ties georgetiemann.com 160-1226-7/0  
10-0 prolene ethicon.com    
9-0 prolene ethicon.com    
8-0 prolene ethicon.com    
Straight micro forceps s-and-t.net FRC-15RM-8  
Curved micro forceps s-and-t.net FRS-15-RM-8  
Dissection needle-holder s-and-t.net B-15-8.2  
Anastomosis needle-holder rumex.net 8-021T  
Micro clamps finescience.com 18055-03 6 x 1mm
Micro clamps applicator finescience.com 18057-14  
Suprahepatic v. cava clamp pharmap.ch 13.349.14  
Quick-Linker rings dltchiropody.co.uk PAR 10 modified scalpel blades
Quick-Linker approximator pharmap.ch UD-04-275 modified Kocher’s forcep

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References

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Comments

1 Comment

  1. Dear Professor/s

    Congratulations for an excellent paper and a very neat video of the procedure. It would have been even more remarkable with explanation and commentary while performing the procedures. While performing the procedure every word of an experienced surgeon is worth and it makes learning easy and minimizes mistakes.

    Sincerely

    Pramod Upadhyay
    National Institute of Immunology, New Delhi, India

    Reply
    Posted by: Pramod U.
    July 14, 2012 - 7:16 AM

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