전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Published 3/19/2013
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Bioengineering

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Summary

설계 근육 조직은 질병 모델로 또한 고기에 대한 대체 소스로, 재생 의료에 큰 가능성이 있습니다. 여기 마우스 myoblast의 전구 세포, 및 전기 펄스에 의해 자극에서이 경우에, 근육 구조의 기술에 대해 설명합니다.

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van der Schaft, D. W., van Spreeuwel, A. C., Boonen, K. J., Langelaan, M. L., Bouten, C. V., Baaijens, F. P. Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation. J. Vis. Exp. (73), e4267, doi:10.3791/4267 (2013).

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Abstract

설계 근육 조직은 재생 의료 및 육류 대체 1로 압력 궤양을 공부하는 예를 체외에서 질병 모델로 사용하기위한 조직의 생산을 포함하는 여러 가지 목적으로 사용 할 수 있습니다. 첫 번째보고 3D 근육 구조는 몇 년 전에 만든 분야의 개척자 Vandenburgh 및 동료 2,3 아르되었습니다. 근육 조직 공학에서 만든 발전 생화학 요인, 줄기 세포 및 전구 세포에 대한 지식의 광대 한 이득의 결과뿐만 아니라하지만, 물리적 요인이 세포 행동 제어에 필수적인 역할을하는 연구자들에 의해 얻은 통찰력의 특정 기반에 있고 조직 개발. 첨단 엔지니어링 근육은 현재 셀 인구 히드로 겔 구조로 구성되어 구성합니다. 우리가 실험실에서이 일반적으로 C2C12, 미 손쥐 뒷다리 근육에서 분리 손쥐 myoblast의 전구 세포, 또는 손쥐 myoblast 세포 라인으로 구성콜라겐 / Matrigel의 혼합물로 xed 두 개의 고정 지점 사이의 도금, 근육 인대를 모방. 다른 세포는,뿐 아니라 L6 쥐 myoblasts 4, 신생아 근육 유래 전구 세포 5, 그러한 인간의 6도 유도 만능 줄기 세포 (IPS 세포) 7과 같은 다른 종에서 성인 근육 조직에서 파생 된 세포와 같은 예를 들어 다른 세포 라인을 고려 될 수있다 . 셀 수축성은 구조 8,9와 문화 약 1 주일 후에 근육 전구 세포의 분화의 긴 축을 따라 세포의 정렬을 발생합니다. 또한, 전기 자극의 응용 프로그램이 어느 정도 8로 차별화 과정을 향상시킬 수 있습니다. 때문에 그 제한된 크기 (8 X 2 X 0.5 mm)의 전체 조직은 생존, 분화 및 세포 정렬을 모니터링 할 공 촛점 현미경을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 특정 응용 프로그램에 enginee에 대한 요구 사항을 따라붉은 근육 조직은 경우에 따라 다릅니다, 다른 종에 고기 대체 번역이 필요한 역할을하는 동안 재생 의료에 대한 예를 들어 사용, 조직 크기와 vascularization의 최대 크기 조절이 필요합니다.

Protocol

1. 손쥐 Myoblast의 전구 세포 또는 C2C12 세포의 문화

  1. 처음 Shefer 및 동료 (10)에 의해 출판하고 나중에 콜린스 외. 11 Boonen 외. 12 적응 프로토콜에 따라 세포를 분리 및 액체 질소에 이것들을 저장합니다. 이 마우스, 예를 들어 C57Bl / 6이 필요합니다. 다른 방법은 예를 들어 리 Y 외하여 시각화 실험의 저널에 출판하는 방법, 다른 실험실에 사용됩니다. 13. 시약 및 장비를 들어 당신은 7 페이지와 8의 표라고합니다. 하나의 마우스에서 근육에서 일반적으로 액체 질소의 약 20 병을 cryopreserve하기에 충분한 세포를 얻을 수 있습니다. 다음, 우리는 액체 질소 저장에서 세포를 해동 할 수있는 프로토콜을 시작합니다.
  2. 25cm 2 Matrigel (1 MG / ML) 코팅 조직 배양 플라스크에 한 유리 병에서 세포를 놓고 이루어진 성장 매체 (GM) (335 ML DMEM 고급, 100 ML 태아 bovin을 추가전자 혈청 (FBS), 50 ML HS, 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML L-glutamin, 5 ML 닭 배아 추출물 (혼)).

참고 : 상온에서 2 시간에 코트 흡인하여 Matrigel을 제거합니다.

  1. 세포는 약 삼일마다 1시 3분 하위 문화.
    이 말의 의미는 : 일 3 : 한 75cm 2 플라스크에서 두 150cm 2 플라스크 (코팅 플라스크에 preplating 30 분 포함)에 대한 통로 셀 : 일 6시 75cm 2 플라스크에 한 25cm 2의 항로 세포. 일 9 전송 한 150cm 2 병 세 150cm 2 플라스크 (필요한 경우 preplate가 다시 세포의 표현형에 따라)에 사용할 1 개의 트리플 150cm 2 병, 또는 경우에. 하루에 12에 세포가 근육 구조에 퍼 뜨리고위한 준비가되어 있습니다.

참고 사항 : - 트리플 150cm 2에 따라 세포의 수는 약 4.5 X 10 6 세포 될 것입니다.
-로 사용다른 isolations의 재산이 시딩시 세포의 혼합 인구를 얻기 위해 그들을 혼합합니다.

참고 : 기본 셀 작동하지 않을 경우, C2C12 myoblasts는 좋은 대안입니다.

2. 공학 골격근 화장지에게

  1. "경화 대리인"(10시 1분)와 "탄성"을 혼합하여 실리콘 접착제를 준비합니다. 한 삼각면 (; 그림 1 모양 집과 같은)에 벨크로의 5mm 평방 세그먼트 - + / 잘라. 사각형 사이의 약 12​​ mm의 공간에서 6 잘 문화 판의 우물에 접착제 벨크로.

참고 사항 : - 만 벨크로의 부드러운면을 사용하고 측면 위쪽을 향하고 있습니다.
- 지붕이 서로 마주 있는지 확인하십시오.
- 만 실리콘 접착제와 벨크로를 커버 잘 전역에 접착제를 전염되지 않습니다.
- 나중에 전기 자극의 경우는 잘 PL 수직 방향으로 구조를 정렬하는 관련(긴 축을 따라) 먹었다.

  1. 진공 오븐에 하룻밤 건조하게 놔둬, 가열하지, 주로 기포를 제거합니다. 15 분의 우물과 부화 70 % EtOH를 추가하여 살균. PBS로 3 배 씻어 15 분에 UV 아래 넣어. 우물에서 모든 PBS 및 사용까지 보육에 벨크로와 장소를 제거합니다.
  2. 냉장고에 Matrigel 솔루션을 해동 곧 3D 구조를하기 전에 원하는 농도로 콜라겐 솔루션을 준비합니다. 멸균 0.02 % 아세트산 (최종 농도 3.2 밀리그램 / ML)와 주식 콜라겐을 희석.

참고 : 얼음의 모든 둡니다.

  1. GM과 횟수에 resuspend 세포를 Trypsinize. 보육의 원심 분리기 튜브에 세포를 둡니다.
  2. 이 콜라겐 솔루션으로 0.5M NaOH를 추가, 당신은 관 (표 1에 따라)에 변경하고자하는 구조의 숫자 콜라겐 주식 솔루션의 원하는 금액을 추가 밝은 분홍색 colo까지R은 7.5의 산도를 나타내는 수 있습니다. 등을 아래로 pipetting하여 부드럽게 섞어서 거품 형성을 피할 수 있습니다. 그런 다음 Matrigel을 추가하고 부드럽게하지만 철저하게 매우 섞는다. 마지막으로, 콜라겐 / Matrigel 혼합물 (해당 금액에 대한 표 1 참조)에 GM을 추가합니다.

참고 사항 : - 얼음의 각 단계를 수행! Matrigel과 콜라겐이 증가하고 온도에서 쉽게 젤 것이다.
- 색상이 실제로 분홍색입니다 조심해! 산도의 증가는 빠른 겔화를 유도합니다.
- 콜라겐의 최종 농도 : 1.6 MG / ML.

  1. 5 분 1,000 rpm으로 세포의 원하는 금액을 원심 분리기하고 표면에 뜨는을 제거합니다.

참고 : - 구성 당 세포의 숫자가 조정해야하는 세포의 활동에 따라. 일반적으로 세포의 수는 구조 당 750,000 사이 1,250,000 세포를 자리 잡고 있습니다.

  1. 세포 펠렛을 resuspend하는 겔 혼합물의 일부를 사용하여나머지 혼합물에 세포를 전송하고 철저하게 혼합하지만, 기포를 도입하지 않고.
  2. 보육 및 피펫 벨크로 첫째로 셀 겔 혼합물의 0.35 -0.4 ML의 preheated 잘 접시를보십시오. 그런 다음 첨부 파일 사이트 사이의 중심에서 혼합물을 피펫과 벨크로로 확장하기 시작합니다. 마지막으로, 벨크로 조각 주위에 두 개의 벨크로 앵커와 피펫 사이의 간격을 채우기 위해 젤의 나머지를 사용합니다.
  3. 젤은 양도 할 정도로 단단한 경우주의 깊게 5-10 분 후 확인 즉, 부드럽게 요리를 누르고 젤이 단단한 경우 시각적으로 검사한다. 그렇다면, 보육에 요리를주의 깊게 배치합니다. 보통, 그들은는 열명 분 후에 픽업 할 수 있습니다. 그런 다음, 1-2의 시간 후, 부드럽게 따뜻한 GM의 4 ML 각 젤을 입혀 라.

참고 :-DO 접시를 다룰 때 어떤 힘차게 운동을하지.

  1. (성장 매체 차별화 매체에 의해 GM 교체여자의 배아 추출물없이) 24 시간 후, 신선한 중간마다 2~3일로 교체하십시오. 일 7 당신이 융합 된 근육 섬유에서 교차 결 개발에 얼룩으로 평가 될 수 있기 때문에, 성숙 지향적 인 근육 섬유를 얻은 것입니다.

3. 전기 자극

  1. 안전 캐비닛의 UV 이하 70 %의 에탄올과 이후 건조에 사용하기 전에 ionoptix 판에서 전극을 (시약 및 장비의 표를 참조) 소독하다. 구조와 문화 판 위에 전극으로 판을 놓고 문화 판과 보육에 송금 뚜껑을 다룹니다. 적절한 케이블로 Ionoptix C-맥박 조정 장치를 연결합니다.

참고 : 전극은 근육 구조 (그림 2)와 함께 병렬 배치됩니다.

  1. 예상대로 자극 프로토콜을 적용합니다.

참고 : 우리는 일반적으로 4 V / CM을 사용하여2Hz의 주파수에서 6ms 펄스. 문화 매체에게 자극 동안은 24 시간을 변경합니다.

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Representative Results

최종 제품은 그림 3에 표시된 근육 구조 될 것입니다. 조직의 크기는 길이 약 8mm, 폭 2mm와 두께 0.5 mm 될 것입니다. 차별화 동안 전기 자극은 마이 오신 중쇄 isoforms의 표현을 변경되지만, 차별화 매체 (8)에 의해 유도로 크게 차별화 프로세스를 개선하지 않지만, 전기 자극은 근육의 기능을 확인하기 위해 절차의 끝 부분에 적용 할 수 왜냐하면 완전히 개발 sarcomeres와 근육이 전기 펄스에 계약을 체결 할 수있을 것입니다.

차별화와 성숙은 조직 또는 전체 마운트 스테인드 조직 샘플로 만든 두 섹션에 근육 성숙 마커 또는 교차 결 개발 (알파 actinin에 대한 착색)에 대한 유전자 발현 평가 및 착색에 대한 정량적 PCR을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 근육 성숙과 차별화를 침착 하테드 유전자와 마이 오신 중쇄 표현이 MyoD, myogenin, MFR4 및 MLP, 그리고 MYH 1, 2, 4, 8 8이 포함되어 있습니다. 실제로 형성되어 근육 조직이 유전자 표현, immunohistochemical stainings 및 전기 자극에 의해 수축 유도에 따라 근육 조직,임을 증명는 이전에 출판 myoblast의 전구 세포와 C2C12 세포로 만든 근육 조직의 스테인드 크로스 섹션과 그림되었습니다 에서이 논문은 그림 4에 표시됩니다.

용액 μl의 볼륨 (10 근육을 만드는 경우)
콜라겐 (3.2 MG / ML, 0.02 % 아세트산로 희석) 2570 (51.3 %)
NaOH (0.5M) 10 (0.2 %)
Matrigel 430 (8.6 %)
성장 매체 2000 (39.9 %)
합계 5010 (손실을 흘리고, pipetting에 충분 충분 함)

표 1. 조직 엔지니어링 근육의 생성을위한 세포와 젤의 혼합물이 구성합니다.

그림 1
1 그림. 벨크로의 조각을 절단.

그림 2
그림 2. 그림은 근육의 바닥에서 전극의 위치를 표시하는 6 잘 접시의 우물에 구조를 취. 전극이 (흰색 화살표로 표시) 근육 구조에 평행하게 배치됩니다.

그림 3
그림 3. 조직6 잘 문화 판에 벨크로의 두 조각 사이에 근육을 설계.

그림 4
4 그림. C2C12 (A)와 MPC의 상호 강선의 전형적인 예는 (B) 엔지니어링 골격 근육 조직 인치 비 자극 mBAMs (차별화의 날 8)의 냉동 섹션은 sarcomeric α-actinin (빨간색), sarcomeric 마이 오신 (녹색에 얼룩이 있었다 )과 핵 (파란색). 의 박스 지역 (AA-AB와 바 - BB) 배율 (A, B) α-Actinin (빨간색)와 sarcomeric 마이 오신 (녹색). 8에서 허가를 재 인쇄하는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

근육 조직의 공학 재생 의학의 약물 검사에 대한 질병 모델 등과 고기 생산을위한 사용하기위한 잠재력이 있습니다. 그러나 이러한 응용 프로그램에 대한 요구 사항은 다양합니다. 콜라겐은 세포 정렬이 가능하기 때문에 이전의 2D 연구 12 결정 myoblast의 전구 세포는 지하 막 파생 된 단백질의 존재를 필요로하기 때문에 우리는 콜라겐과 matrigel의 조합과 협력하기로 결정했습니다. 또한, 섬유소의 젤은 우리의 실험실에서 테스트하고 콜라겐과 Matrigel ™의 혼합물이 수행 특히 조직 압축 14 연결되지 않는 C2C12 myoblast 및 전구 세포를 지원하지 듯되었습니다. 셀 라인 15를 사용하는 동안 여기에 설명 된대로 모델은 압력 궤양 손상에 대한 연구에서 이미 사용되었습니다. 재생 의료 어플리케이션의 경우, 인간의 위성 세포의 번역은 최근 6,16 만든되었습니다. 또한,고기 소비 대체 소스로 기술은 잠재력이 하나 있습니다. 우리 생각에는 그러나, 현재의 기술은 소비뿐만 아니라 병원에서의 사용을 촉진하기 위해 다음 단계로 진행해야합니다. 예를 들어, 차별화 신생아 단계 주변에 정차하며 전력 생산은 근육이 생체에 생산보다 훨씬 작습니다. 마우스, 쥐, 인간의 줄기 세포는 3D 구조, 격리에 구현 될 수 있지만 또한, 특히 근육의 줄기 세포를 파생 농장 동물의 차별화 및 성숙은 아직 1이 지금까지 개발되지 않습니다. 또한, Matrigel과 동물 유래 혈청 요구의 사용은 1 생략 할 수 있습니다. 재생 의료에 응용 프로그램을 촉진하기 위해 조직의 크기가 증가 할 수 있고, (신) vascularization과 산소와 영양소 확산 한계를 극복하기 위해 재관류의 생물 반응기 시스템의 사용이 필요합니다. 작은 구조 H의 일부 초기 vascularization 연구번가는 지난 몇 년 9,17,18을 썼는데.

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Disclosures

저자는 공개 할 수 없어요.

Acknowledgements

저자는 배양 그림 2에 표시되는 조직을위한 Yabin 우 감사 할 사진이 바트 반 Overbeeke로 촬영되었다. 작품은 재정적 SenterNovem, 교부금 ISO 42022에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrigel-growth factor reduced Beckton and Dickinson
DMEM (high glucose)* Gibco 42430
Advanced DMEM Gibco 12491
Horse serum Gibco 65050-122
Fetal bovine serum Greiner 758075
0.45 and 0.22 μm syringe filter* Whatmann (Schleicher and Scheull) 10462100
L-glutamine Gibco 25030024
Penicillin/streptomycin Gibco 10378016
Amphotericin Gibco 15290-018
Culture plastic Greiner Includes culture flasks and pipets
Chick embryo extract United States Biological C3999
Pasteur pipet* Hilgenberg Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm
Pasteur pipet* Hilgenberg Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm
Pasteur pipet VWR 612-1702
Collagenase type I* Sigma C0130-16
40 μm cell strainer* BD Falcon 352340
19G needle
Elastomer Dow Corning corporation 3097358-1004 Silastic MDX 4-4210#
Curing agent Dow Corning corporation Silastic MDX 4-4210#
Velcro Regular store You can buy this at a regular store, only use the soft side
Collagen type I, rat tail BD Biosciences 3544236
C-Pace EP Culture Pacer Ionoptix
6-well culture dishes for electrical stimulation Beckton Dickinson-Falcon BD Falcon #353846
C-Dish culture dish electrodes Ionoptix
* Needed for the isolation of cells (point 1.1)
# Together in one kit

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References

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