PHluorin изображений с метками рецепторов вставки в плазматическую мембрану в первичной культуре нейронов мыши

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

По теги внеклеточных доменов мембранных рецепторов с superecliptic pHluorin, и эти изображения слияния рецепторов в культуре нейронов мыши, мы можем напрямую визуализировать отдельные везикулярного события вставки рецепторы клеточной мембраны. Эта техника будет играть важную роль в выяснении молекулярных механизмов, регулирующих рецепторов вставки в плазматическую мембрану.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Sampson, S. B., Lin, D. T. Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (69), e4450, doi:10.3791/4450 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Подготовка культуры мышь Glia для нейронов принадлежности культуры

  1. T75 колбы покрыты раствора коллагена (1:3 разбавление Purecol в DDH 2 O). Колбы устанавливаются вертикально и оставили на ночь сушиться в капюшоне культуры ткани.
  2. Препарирование буфера (ACSF: 119 мм NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 30 мМ глюкозы, 25 мМ HEPES, рН 7,4, без кальция) и глии средств массовой информации (DMEM с добавлением 10% FBS, 10 ед / мл пенициллина, 10 мкг / мл стрептомицина и Glutamax) готовят и хранят при 4 ° С до готовности к употреблению.
  3. В день глии культуры, средств массовой информации глии нагревают в течение 30 мин при 37 ° С водяной бане до вскрытия мышей мозг. Эмбриональные или новорожденных мышей усыпляют быстрое обезглавливание. Церебральная кора расчленены под микроскопом рассечение.
  4. Расчлененный тканей мозга перевариваются в папаина раствор (100 мл папаина и 20 мкл 1% ДНКазы I в 2 буфера рассечение мл) при 37 ° C лR 20 мин.
  5. После папаин пищеварения, мозг ткани промывают 10 мл подогретого СМИ глии. Свежее медиа глии (2 мл) добавляют к переваривается ткани мозга, и ткани растирают с огнем полированное стекло пипетки Пастера.
  6. Свежее медиа глии (8 мл) добавляют к диссоциированных тканей. 70 мкм клетки-фильтр используется для фильтрации диссоциированных подвески ткани. Затем клетки высевают в колбы T75 (обычно 2-3 эмбрионов могут семян одна колба T75) и помещают в 37 ° C культуре клеток инкубатора.
  7. На следующий день, средств массовой информации из колбы T75 всасывается. Колбы промывают 10 мл PBS. Свежее медиа глии (10-15 мл), затем добавляли в каждую колбу.
  8. В течение 10-12 дней, глии в T75 колб должна быть вырожденной. Глиальные клетки промывали PBS и 5 мл 0,05% трипсина добавляется к каждому T75 колбу.
  9. После трипсина инкубации при 37 ° C в течение 5 мин, глиальные клетки разобщены и глиальных клеток из каждой колбы T75 делятся на дверазличных коллагена покрытием колбы T75.
  10. Культура вставками (Millipore PICM03050) получают путем размещения их в 6-луночные планшеты, покрытие их с коллагеном и воздушной сушки в течение ночи. Glia СМИ (2 мл каждая) помещают под каждую культуру вставки.
  11. Glia из сливной T75 Колбы трипсином и высевают на культуру вставки (одна колба T75 в 6-луночный планшет, 2 мл каждая вставка). Эти вставки глии культуры будут использованы для состояния нейронов культур.

2. Нейронов культуры

  1. Покровные стекла для нейронов культуры очищаются путем замачивания в 70% HNO 3 по крайней мере, в течение ночи. Покровные затем промывают DDH 2 O минимум в 3 раза и сушат в духовке Isotemp (> 200 ° C) в течение ночи.
  2. Очищенные покровные находятся в 6-луночный планшет, одним покровным на лунку. Покровные стекла покрыты поли-L-лизина раствор (2 мл, 0,1% в 100 мМ борной кислоты, рН = 8,5) в течение ночи при 37 ° C инкубатора.
  3. поли-L-лизина раствор удаляется из покровных и покровные промывают 3 раза автоклавного DDH 2 O. Покровные затем инкубируют при 37 ° C инкубаторе в течение ночи в покрытие средств массовой информации (Neurobasal с добавлением 5% инактивированной лошадиной сыворотки, 10 ед / мл пенициллина, 10 мкг / мл стрептомицина, Glutamax, 2% B27 добавки добавляют в покрытие среде В день она используется).
  4. На следующий день, покрытие СМИ удаляется и 2 мл свежей среды покрытий с B-27 добавляется в каждую лунку, которая имеет покровное стекло.
  5. Беременных мышей (E15-18) усыпляют с CO 2, и эмбриональных мышей эвтаназии путем обезглавливания. Гиппокамп или полосатое тело разрезали из мозговой ткани и помещают в 15 мл коническую трубку с ледяным буфером вскрытия, по культуре нейронов гиппокампа и полосатого средних нейронов колючих, соответственно.
  6. Расчлененный тканей мозга разобщены с папаином, как описано в шагах 1,4) и 1,5).
  7. Фаосле диссоциации, количество клеток в каждой нейронов подвеска считается с гемоцитометра. Нейроны, которые затем высевают на каждом покровном при плотности 0,4 х 10 6 клеток на лунку 6-луночный планшет и культивировали при 37 ° C инкубаторе в течение ночи (нейроны DIV 0).
  8. Для подготовки вставками глии культуры для кондиционирования нейронов культуры, средств массовой информации глии удаляется из вставляет глии культуры и свежей среде покрытия добавляют (2 мл на вставке и 2 мл под вставку).
  9. На следующий день (DIV 1), покровные с нейроны помещаются под глии культуры вставками, одним покровным в каждую лунку.
  10. Нейроны кормят половина объема свежего подогретого кормления средств массовой информации (с B-27) каждые 3-4 дня, пока они не готовы к трансфекции и визуализации экспериментов.

3. Трансфекция

  1. Нейронные трансфекции осуществляется с помощью Lipofectamine 2000 года. Для каждого нейрона культуры (одной культуры на покровное), 2 мклLipofectamine 2000 и 1 мкг ДНК используется. Свежий Neurobasal среде без добавки используются для разбавления Lipofectamine и ДНК.
  2. ДНК и Lipofectamine инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре после смешивания.
  3. Сохранить 1 мл средства массовой информации из-под каждой вставки культуры глии, и 1 мл внутри каждой вставки, и передать средства массовой информации коническую трубку. Добавить такой же объем кормления СМИ + B27, чтобы сохранить среду и инкубируют при 37 ° C. Эта среда используется для нейронов культуры после трансфекции.
  4. После 20-минутного Lipofectamine / ДНК инкубации, вставки глии культуры удаляются мгновенно с 6-луночных планшетах. 200 мкл Lipofectamine / ДНК смесь добавляют к каждой покровное с нейронами. Вставками глии культуры, затем вернулся в каждой лунке, над нейронами. Поколение пузырьков под мембраной культуры вставками следует избегать. Нейроны инкубировали с Lipofectamine / ДНК смесь при температуре 37 ° С в течение 2-4 часов.
  5. После тыс.В 2-4 часов инкубационного периода, глии вставки удаляются снова. Культуральной среде с Lipofectamine / ДНК смесь снять с каждой лунке. Средства массовой информации сохраняется в шаге 3,3) добавляют к нейронам (2 мл на лунку). Вставками Glia культуры вернулся в каждую лунку, и глии средств массовой информации из каждой пластины удаляется, и 2 мл средства массовой информации с шагом 3,3) добавляют в каждой вставки.
  6. Нейроны культивировали в течение дополнительных 24-72 часов, чтобы выражение трансфекции кДНК перед TIRF изображений производится на эти нейроны.

4. TIRF изображений

  1. Искусственные цереброспинальной жидкости (ACSF: 119 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 30 мМ глюкозы, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 25 мМ HEPES, рН = 7,4) будет использоваться для живого изображения экспериментов. Наши TIRF системы визуализации является обычай настройки с 100-мВт голубой лазер для возбуждения и электронно Умножив Прибор с зарядовой связью (EMCCD) камеры для детектора.
  2. До изображений экспериментов, ACSF предупрежден в 37 и Dнапример, C водяной бане в течение 30 мин. Отопление вставки для живого изображения помещается на столик микроскопа и отопления вставки, лазер, и камера нагревается, по крайней мере за 30 минут до начала изображений экспериментов.
  3. Покровное с трансфицированных нейронов собраны в живых изображений камеры. Подогретого ACSF помещают в камеру после того, как камера в собранном виде; этот шаг должен быть завершен как можно быстрее.
  4. Как только камера ставится на отопление вставки на столике микроскопа, трансфицированных нейронов определяются визуально под эпи-флуоресцентный режим съемки.
  5. После здоровые нейроны трансфицированных определены (см. рисунки 1 и 2), как правило, выполняют 1 мин фото-отбеливатель для устранения уже существующих pHluorin флуоресценции на мембране плазмы, как pHluorin-рецепторов на мембране имеют очень высокие уровни флуоресценции при TIRF изображений первого запуска, который мешает визуализации отдельных модулейertion событий.
  6. После photobleach, усиление установка ВЭУ на EMCCD камера установлена ​​на максимум, а запись выполняется в течение 1 мин при 10 Гц.
  7. Каждая запись будет содержать 600 изображений. Отдельные события вставки определены, играя записи обратно, используя ImageJ. Отдельные события вставки проанализированы вручную с помощью ImageJ.

5. Представитель Результаты

В соответствии нейронов культуры является ключом к успешному живого изображения экспериментов. Рисунке 1 показана нейронов гиппокампа мыши культивировали, используя нашу протокол от 11 до DIV DIV 18. Как видно из фотографий, что нейроны разработали обширные процессы и, что дендритные процессы покрыты плотной с дендритных шипиков, признаки того, что эти нейроны здоровых в культуре. Наша культура протокол также может быть использован для других типов нейронов в головном мозге. Например, мы недавно использовали этот протокол для культурыполосатого средних нейронов колючих в исследование с целью изучения дофаминовых D2-рецепторов (DRD2) вставки в культуре мыши полосатого средних нейронов колючих 9. рисунке 2 показаны средние мыши полосатой колючих нейроны культивировались с помощью нашего протокола на DIV 8. Мы также успешно выполняется TIRF изображений superecliptic pHluorin с метками DRD2s этого типа нейронов. Рисунке 3 показано выражение pHluorin с метками DRD2 (рН-DRD2) в среде нейронов колючих и визуализации рН-DRD2 включение в этот нейрон.

Рисунок 1
Рисунок 1. Гиппокампа мышей культуры с помощью метода интерфейса культуры. DIV: дней в пробирке, в день культура рассматривается как DIV 0. Из фотографий видно, что зрелые нейроны гиппокампа в этом типе культуры между DIV DIV 11 и 15. В DIV 11 и 13, дендриты нейронов покрыты filipodia и незрелых шипами. В DIV 15 и18, дендриты нейронов покрыты крупными шипами, что свидетельствует о более зрелые нейроны. Левая панель: низкого увеличения изображения мышью нейронов гиппокампа в различных возрастах. Правая панель: с высоким увеличением изображения (увеличение на нейронных дендритов левой панели) нейронов дендритные процессы с дендритных шипиков в разном возрасте.

Рисунок 2
Рисунок 2. Мыши полосатого средних колючих нейронов культуры с помощью метода интерфейса культуры. Нейроны в изображения на DIV 8.

Рисунок 3
Рисунок 3. Мышью полосатого средних колючих нейронов трансфицировали супер эклиптики pHluorin с метками дофаминовых D2-рецепторов (рН-DRD2). Изображение слева максимальной проекции интенсивности замедленной записи (600 изображений, 100 мс на изображение). Белые стрелки указывают на отдельные везикулярного введения рН-DRD2. Это изображение сохраняет вставки информации в измерении х, но теряет времени. Изображение справа показывает уг максимальной интенсивности проекции, в которой XYT стек поворачивается на 90 градусов вокруг оси у, а максимальная пикселей на каждой оси абсцисс линии проецируется на одной оси у пикселя. Это изображение сохраняет информацию вставки вдоль оси у, но теряет оси Х информации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

По неизвестным причинам, мыши нейроны всегда сложнее, чем крысы культуре нейронов. По нашему опыту, смешанной культуре нейронов и глии хорошо работает для первичной культуре нейронов мыши. Однако такая смешанная культура не подходят для экспериментов TIRF изображений, так как в этом типе культуры нейронов и их процессы имеют тенденцию к росту на вершине глиальных клеток, располагающий нейронов somata и дендритные процессы вне досягаемости микроскопии TIRF. Таким образом, нижняя плотность нейронов культуры с несколькими глии на покровное стекло идеально подходит для TIRF изображений. Мы впервые опробован метод Banker 19, 20, в котором в нижней части культуры посеяны блюдо с глии и нейронов высевают на покровное и помещен вверх тормашками в культуре блюдо. Покровное и глии слоя разделены на три мелких капель воска на покровное. Этот метод хорошо работает для небольших размеров покровные (например, 15-мм или 18-мм покровные), но когда мы проверили использование 25-мм сотрудничестваverslips, нейроны недалеко от центра покровные не так хороши, как те, рядом с покровным края.

Хотя причина этого различия в нейронной здоровьем не было ясно для нас, мы рассудили, что это может быть связано с ограниченной диффузии питательных веществ в центр покровного области. Поэтому мы обратились к методу интерфейса культуры, описанные в этой рукописи, в качестве мембраны культуры вставки позволяют свободной диффузии питательных веществ к нейронам на покровные. Мы посеяны нейронов на 25-мм покровные, с нейронами вверх. Мы посеяны глии в области культуры вставки, и поставил вставки глии подачи сверху покровным. Мы решили, что метод интерфейса культура превосходит другие методы, которые мы испытали при использовании 25-мм покровные для низкой плотности нейронов мыши культуры, и дает устойчивые результаты для TIRF изображений. Для количественной оценки свойств рецепторов вставки (частота, амплитуда), контрольная группа с нейроны трансфицировали Wго дикого типа pHluorin с метками рецепторы должны быть всегда включены. Эта контрольная группа также служит для проверки качества нейронов культуры.

Наши TIRFM система построена на основе ручной микроскоп Zeiss AxioObserver (Carl Zeiss MicroImaging, Inc Thornwood, Нью-Йорк). Лазерного возбуждения является Ньюпорт-488nm 100mW Голубой Лазерная система (Newport Corporation, Irvine, CA). Лазер соединен с ползунком Zeiss TIRF через KineFLEX-P-2-S-488-640-0,7-FCP-P2 оптического волокна (Point Source, Митчелл Point, Hamble, Великобритания). Зеркало Z488RDC дихроичным (Chroma Technology Corporation, Сильфонные Falls, VT) была использована для отражения входящего лазера на Zeiss α-план 100X объектива (NA = 1,46, Carl Zeiss). ET525/50 выбросов фильтр (Chroma Technology Corporation) была использована для обнаружения флуоресценции GFP. Evolve EMCCD камеры (Фотометрия, Тусон, Аризона) был использован в качестве детектора. 2.5X объектив реле была вставлена ​​между портом микроскоп камеры и камерыэры в целях достижения оптимального пространственного разрешения (0,064 мкм на пиксель при использовании 100X NA = 1,46 цели). Камеры поддерживалась на уровне -80 ° C во время экспериментов изображений. Uniblitz LS6 затвора контролируется VMM-D3 контроллера (Vincent Associates, Рочестер, штат Нью-Йорк) были интегрированы между главой лазерных и волоконно пусковой установки. Данные были получены с помощью μManager программного обеспечения ( http://www.micro manager.org / ).

Все изображения эксперименты проводились при температуре 37 ° C в ACSF растворе, содержащем 2 мМ CaCl 2. Это решение ACSF доводят до рН = 7,4 при комнатной температуре. Когда нагревают до 37 ° С, рН этого ACSF становится 7,2, что является оптимальным для нейронов в культуре. Во время приобретения, мощность лазера установлена ​​на максимум, как для фото-отбеливатель и для сбора данных. Камера экспозиции была установлена ​​на уровне 100 мс, а скорость сбора данных составляет 10 кадров в секунду (10 Гц). EMCCD прирост был установлент максимум. Записи были проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ (Расбанд, WS, NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/ , 1997-2012), и вставки события были зарегистрированы и проанализированы вручную. Всего событий в минуту на единицу площади поверхности, были приняты как частота вставки и были нормализованы с контрольной группой за 100%. Yt оказываемых изображения были получены в ImageJ, вращая оригинальные XYT стек 90 ° вдоль оси у, а максимальная интенсивность каждой линии х был проецируются на один пиксель по оси Y с использованием максимального алгоритм проекции интенсивности в ImageJ.

Вставка событий, как правило, наблюдается внезапное появление флуоресцентные пунта (быстрый рост фаза), а затем распадающейся фазе, которая представляет рецептор диффузии на плазматическую мембрану 7, 9. Появление флуоресцентные пунта с медленным ростом фазы или тех, кто не очевидно фазе распада (внезапная disappearance) исключены из анализа данных, так как эти события, которые могут представлять торговли внутриклеточные везикулы, которые имеют менее кислым просвет (например, из эндоплазматического ретикулума). Photobleach уже существующей популяции поверхности рецепторы также свести к минимуму вклад уже существующих кластеров рецепторов поверхности клеточной мембраны. На сегодняшний день все наши данные анализируются вручную с помощью ImageJ. Дальнейшее развитие компьютерных алгоритмов для автоматического обнаружения событий и анализ данных будет иметь важное значение для содействия адаптации и применения этого метода визуализации для исследования рецепторов вставки в плазматическую мембрану.

Для того, чтобы визуализировать отдельные везикулярного события вставки pHluorin-меченных рецепторов, несколько важных параметров должны быть приняты во внимание. Во-первых, лазерное возбуждение должно быть достаточно сильным, чтобы включить обнаружение флуоресценции от одиночных пузырьков. В нашем заказные системы, мы использовали в 10 0-488-мВт нм лазер, как наш источник возбуждения. Во-вторых, детектор изображений система должна иметь как чувствительность и скорость получения данных в реальном масштабе времени, динамической вставки рецепторов. По этим причинам, мы используем EMCCD в нашей системе. Сочетание сильного лазерного возбуждения и EMCCD детектор предлагает одну молекулу GFP способность обнаружения в нашей системе формирования изображений. Наш выбор специально разработанных система TIRF основан на достижении максимальной производительности имеющихся ограниченных ресурсов. Стоит отметить, что любые коммерчески доступные системы TIRF с достаточной мощности лазерного возбуждения (100-мВт 488-нм лазер достаточно для наших целей, и легко доступен на большинстве коммерческих платформах) и EMCCD камеры также должны быть пригодны для такой визуализации исследований. Таким образом, адаптация таких исследований изображений для нейронов не ограничена производительность системы TIRFM, но по качеству нейронов культуры и последовательности нейронных культур.

ove_content "> В-третьих, в связи с начальной флуоресценции от существующих pHluorin с метками плазмы мембранных рецепторов, photobleach под режим TIRF, как правило, необходимы для обнаружения флуоресценции от одного пузырька. Мы обычно выполняют 1-минутный photobleach, используя режим TIRF изображения при максимальном Мощность лазера, один раз в нейрон визуально определили, что приводит к устранению большинства уже существующих флуоресценции поверхности pHluorin. Важно также иметь в виду, что высокая мощность лазерного возбуждения также увеличивает возможность повреждения лазерным и фототоксичности. Исходя из нашего опыта , с использованием 100-мВт 488-мВт лазер в качестве источника возбуждения не представляется ввести заметны повреждения нейронов в период сбора данных, обеспечивая при этом достаточную мощность лазера для визуализации рецепторов в одном пузырьков. дополнительные важным фактором является то, что различия в типы и количество рецепторов в каждом пузырьке также влияет на требования лазерного возбуждения.Например, ранее мы смогли рассмотреть регулирования рецептора глутамата GluA1 субъединицы вставки в плазматическую мембрану использованием 50-мВт лазерного возбуждения 7. Мы считаем, что каждый пузырек рассмотрены в этом исследовании, содержащийся 56 ± 6 GluA1 молекулы, похожие на оценке, сделанной другой группой, используя аналогичные методы 12. В нашем недавнем исследовании DRD2, мы подсчитали, что каждый пузырек содержит 30 ± 1 молекулы, и 100-мВт лазерного было достаточно для этого исследования. Однако, из-за высокого уровня фонового шума в живых клетках, экспертиза пузырьков, содержащих только несколько молекул рецептора (например, 5-10) может потребоваться лазер мощностью более 100 МВт для того, чтобы достичь достаточной сигнал- шум для визуализации рецепторов вставки в плазматической мембране нейронов. Нахождение правильного баланса сил чувствительность и возбуждение важно для планирования успешной учебы.

Использование TIRFM, чтобы яМаг superecliptic pHluorin с метками рецепторов была применена для нескольких различных типов нейронных рецепторов 7-17. Тем не менее, очень важно иметь в виду, что наш нынешний метод основан на пометки рецепторов молекул GFP и избыточная экспрессия отмеченных рецепторов. Присоединение GFP молекулы внеклеточного домена мембранного белка может влиять на функцию белка, и поэтому важно убедиться, что это теги стратегия не значительно влияют на функции белка под следствием 9. Кроме того, сверхэкспрессированный рецепторов может или не может быть предметом регуляторных механизмов, которые регулируют торговлю эндогенных рецепторов. Независимые методы Поэтому необходимы для проверки результатов, полученных изображений сверхэкспрессированный pHluorin с метками рецепторов. Например, в нашем исследовании GluA1 вставки 7, выражение поверхности и синаптической торговли эндогенных GluA1 рецепторы были подтверждены ипеть стандартных иммуноокрашивания / или биохимические методы электрофизиологических подходов. В общем, наши изображений подход, в сочетании с другими стандартными методами для мембранных белков торговли, скорее всего, играть важную роль в рассекает подробную молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих плазменные мембраны вставки других мембранных белков в нейронах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа поддерживается запуск средств из лаборатории Джексона.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
purified bovine collagen solution (Purecol) Advanced Biomatrix 5005-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14185-045
penicillin-streptomycin (Pen Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
sodium pyruvate GIBCO, by Life Technologies 11360-070
DMEM High Glucose GIBCO, by Life Technologies 10313-021
fetal bovine serum (FBS)
GlutaMAX GIBCO, by Life Technologies 35050-061
papain Worthington Biochemical Corp. LS003126
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) Sigma-Aldrich DN25-10MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
0.05% trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300-054
poly-l-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P2636-1G
boric acid Fisher Scientific BP 168-500
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103-049
B-27 Serum-Free Supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
heat inactive horse serum GIBCO, by Life Technologies 26050-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668 019
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Culture Insert EMD Millipore PICM03050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  2. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. (2012).
  3. Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
  4. Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
  5. Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
  6. Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
  7. Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
  8. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
  9. Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. (2012).
  10. Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
  11. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
  12. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
  13. Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24, (AMPARs), 5172-5176 (2004).
  14. Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
  15. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
  16. Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
  17. Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
  18. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).

Comments

1 Comment

  1. I want to get a copy of this video,who can help me?

    Reply
    Posted by: zhang j.
    June 16, 2014 - 9:59 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics