成像pHluorin标记插入到质膜受体原代培养的小鼠神经元

Neuroscience

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Summary

通过标记与superecliptic pHluorin膜受体的胞外域的,并通过成像这些融合在培养的小鼠神经元受体,我们可以直接可视化个别水泡插入事件到质膜的受体。这种技术将有助于阐明受体插入到质膜的分子机制。

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Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Sampson, S. B., Lin, D. T. Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (69), e4450, doi:10.3791/4450 (2012).

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Abstract

质膜(PM)和细胞内受体之间贩运的机制更好地理解需要具有出色的空间分辨率和时间分辨率的实验方法。此外,这种方法还必须有分辨能力定位于PM在细胞内的受体。最重要的是,检测的受体,在一个单一的囊泡需要优异的检测灵敏度,因为每个囊泡进行只有一小数量的受体。检查受体活动的标准方法,包括表面生物素的生化检测,缺乏必要的空间和时间的决议;和荧光显微镜检查的immunolabeled表面的受体,这需要细胞化学固定,因此缺乏足够的时间分辨率1-6。为了克服这些限制,我们和其他人开发的,采用了一种新STRAtegy,使可视化动态插入的受体出色的空间分辨率和时间分辨率7-17 PM。该方法包括pH敏感的GFP,superecliptic的pHluorin 18的N-末端胞外结构域的受体的标记。 superecliptic pHluorin荧光在中性pH值和非荧光在酸性pH值(pH值<6.0)的独特属性。因此,标记受体的非荧光内酸性细胞内转运囊泡管腔或内体舱室时,它们变得容易地可视化,只有当暴露于细胞外的中性pH值环境上的外表面的PM。因此,我们的战略使我们能够区分PM表面受体,在细胞内囊泡。为了达到足够的空间和时间分辨率,以及学习所需的动态贩卖受体的敏感性,我们采用全内反映离子荧光显微镜(TIRFM),这使我们能够实现光学成像(〜170 nm)的最佳的空间分辨率,时间分辨率的视频率显微镜(30帧/秒),且灵敏度来检测单个GFP的荧光分子。成像pHluorin标记的受体TIRFM下,我们能够直接可视个人到PM培养的神经元受体插入事件。这种成像方法可能被应用于任何膜蛋白的胞外结构域,可以标记superecliptic pHluorin,并且将允许的密钥的详细机制不同的膜蛋白(受体,离子通道,运输等)插入到夹层PM。

Protocol

1。准备鼠神经胶质细胞培养的神经元培养空调

  1. 涂有胶原蛋白溶液(1:3稀释Purecol DDH 2 O中)的T75烧瓶。烧瓶一身正气,干通宵的组织文化引擎盖。
  2. 夹层缓冲液(人工脑脊液:119 mM氯化钠,5 mM KCl中,1毫摩尔MgCl 2和30mM葡萄糖,25mM的HEPES,pH值7.4,无钙)和神经胶质细胞介质(DMEM培养液与10%胎牛血清,10单位/ ml青霉素,10 μg/ ml链霉素,和Glutamax)的制备和贮存在4℃下,直到准备使用。
  3. 在当天的神经胶质细胞培养,神经胶质细胞介质加热在37°C水浴老鼠的大脑解剖前至少30分钟。小鼠胚胎或新生儿安乐死的快速斩首。在解剖显微镜下分离出脑皮层。
  4. 解剖脑组织在木瓜蛋白酶溶液(100毫升木瓜蛋白酶和20μl1%DNA酶I在2毫升夹层缓冲液)在37℃下消化FOR 20分钟。
  5. 木瓜蛋白酶消化后,脑组织用10ml预先温热的神经胶质细胞介质漂洗。新鲜的神经胶质细胞的介质(2毫升),然后加入到消化的脑组织,用火抛光的玻璃巴斯德吸管研磨和组织。
  6. 新鲜的神经胶质细胞的介质(8毫升)中加入游离的组织。 A 70微米的细胞过滤器,用于过滤分离的组织悬液。然后将细胞接种于T75培养瓶(一般2-3个胚胎,种子T75烧瓶),置于37℃细胞培养孵化器。
  7. 第二天,从T75烧瓶中的是媒体吸气。将烧瓶用10ml PBS漂洗。新鲜的神经胶质细胞介质(10-15毫升),然后加入到每个烧瓶中。
  8. 在10-12天,神经胶质细胞在T75烧瓶中应该是融合。胶质细胞用PBS漂洗,和5毫升的0.05%胰蛋白酶被添加到每个的T75烧瓶中。
  9. 胰蛋白酶在37℃下温育5分钟后,神经胶质细胞是从每个T75烧瓶中的解离和神经胶质细胞被分成两个不同的胶原蛋白涂覆的T75烧瓶。
  10. 培养插入(Millipore公司PICM03050)的制备是通过将它们放置到6孔板中,涂层与胶原蛋白,并空气干燥过夜。神经胶质细胞介质(每次2毫升)置于下方插入每一种文化。
  11. 胶质细胞用胰蛋白酶消化,并接种到培养插入从汇合的T75烧瓶(1的T75烧瓶中每6孔板中,每次2毫升插入)。这些神经胶质细胞培养插入将使用条件的培养的神经元。

2。神经元培养

  1. 神经细胞培养的盖玻片进行清洗浸泡在70%HNO 3,至少过夜。然后用盖玻片DDH 2 O的至少3倍,并且Isotemp烘箱中干燥(> 200℃)中过夜。
  2. 清洗的盖玻片放置在6孔板中,每孔的一个盖玻片。盖玻片都涂有聚-L-赖氨酸的水溶液(2毫升,0.1%在100mM硼酸,pH值= 8.5)中,在37℃培养箱中培养过夜。
  3. “聚-L-赖氨酸溶液的除去从盖玻片和盖玻片与蒸压DDH 2 O洗涤3次盖玻片然后,保温在37℃培养箱中培养过夜的电镀介质(补充有5%热灭活的马血清,10单位/ ml青霉素,10μg/ ml链霉素,Glutamax; 2%B27补充剂的Neurobasal添加到镀介质的当天使用过它)。
  4. 翌日,除去镀敷介质和2毫升的新鲜电镀媒体与B-27被添加到各孔中,有一个玻璃盖玻片。
  5. 怀孕的小鼠(E15-18)被安乐死与CO 2,和小鼠胚胎用断头安乐死。海马或纹状体解剖从脑组织中,并用冰冷的夹层缓冲区,用于培养的海马神经元或纹状体介质棘状神经元,分别放入15毫升锥形管。
  6. 解剖脑组织用木瓜蛋白酶解离,在步骤1.4)和1.5)中所描述。
  7. Following解离,每个神经元的悬浮液中的细胞数用血细胞计数器计数。神经元,然后接种于每个盖玻片的6孔板中,每孔的密度为0.4×10 6个细胞,并且培养在37℃的培养箱中培养过夜(神经元是DIV 0)。
  8. 为了制备用于调节的培养的神经元,神经胶质细胞培养插入的神经胶质细胞介质除去从神经胶质细胞培养插入和新鲜电镀介质中加入下面的插入物中的插入件和2毫升(2毫升)。
  9. 第二天(DIV 1),与神经元的盖玻片置于下方的神经胶质细胞培养插入,在各孔中的一个盖玻片。
  10. 神经元的输入与体积的一半新鲜预热的供给媒体(B-27),每3​​-4天,直到他们准备的转染和成像实验。

3。转染

  1. 神经细胞转染用脂质体2000。对于每一个神经细胞培养(每一种文化盖玻片),2微升使用脂质体2000和1微克DNA。没有补充新鲜的Neurobasal培养基被用来稀释脂质体和DNA。
  2. DNA与Lipofectamine混合后在室温下温育20分钟。
  3. 下次从每个插入件内部的1毫升的媒体从每个神经胶质细胞培养插管的下方,和1毫升,将介质传送到一个​​锥形管。保存的介质和孵育在37℃,加入相同体积的送入介质+ B27此介质被用于转染后的神经元培养。
  4. 脂质体/ DNA孵育20分钟之后,神经胶质细胞培养插入瞬间从6孔培养板中除去。 200μl的脂质体/ DNA混合物被添加到每个与神经元的盖玻片。神经胶质细胞培养插入各孔中,然后返回到上述的神经元。文化插入膜下的气泡的生成,应避免。神经元与脂质体/ DNA混合物在37℃下温育2-4小时。
  5. 后日Ë2-4小时的潜伏期,神经胶质细胞中插入被删除了。与脂质体/ DNA混合物的培养基从各孔除去。步骤3.3)中保存的介质被添加到神经元(2毫升每孔)。神经胶质细胞培养插入返回到各孔,除去从每个插入的神经胶质细胞介质,并从步骤3.3)中的2毫升的介质加入到每个插入件。
  6. 神经元培养24-72小时,让这些神经元表达的转基因前TIRF成像。

4。 TIRF成像

  1. 人工脑脊液(人工脑脊液:119 mM氯化钠,2.5mM的氯化钾,30mM葡萄糖,2mM的的CaCl 2,1毫摩尔的MgCl 2,25mM的HEPES,pH值= 7.4),将被用于活成像实验。我们的TIRF成像系统是自定义设置了100-mW的青色激光激发,电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)相机的检测器。
  2. 成像实验前,学联组织警告说,在37&D例如,C水浴至少30分钟。实时成像的加热刀片被放置在显微镜载物台上,并加热刀片,激光,和摄像机的成像实验开始前至少30分钟温热。
  3. 与转染的神经元的是,甲盖玻片活成像室组装成。预先温热的人工脑脊液被放置在被组装后的腔室的腔室,此步骤中,应尽可能快地完成。
  4. 一旦被放置在腔室上的显微镜载物台的加热刀片,转染的神经元被确定视觉外延荧光成像模式下。
  5. 健康转染后的神经元被识别(参照图1和图2),我们通常执行1分钟的光漂白剂,以消除在质膜上,预先存在pHluorin荧光在质膜上的pHluorin-受体具有非常高的荧光水平时第一次启动TIRF成像,干扰可视化的个人插件ertion事件。
  6. 光漂白剂,EMCCD相机上的电子倍增器的增益设定是设定为最大,并进行记录,持续1分钟,在10赫兹。
  7. 每个记录将包含600个图像。个别插入的事件都通过播放录音背面使用ImageJ。个人的插入手动使用ImageJ分析事件。

5。代表性的成果

一致的神经细胞培养的关键是成功的实时成像实验。 图1显示了小鼠海马神经元培养我们的协议从11 DIV息18。很明显,从图像的神经元建立了广泛的过程,而树突覆盖密集的树突棘,迹象表明,这些神经元在文化上是健康的。我们的培养方法也可用于其他类型的神经元在大脑。例如,我们最近使用的协议,以文化纹状体中等棘神经元在一项研究中,研究多巴胺D2受体(DRD2)插入在培养的小鼠纹状体的中等棘神经元9。 图2显示了小鼠纹状体中等棘神经元培养8 DIV使用我们的协议。我们还成功地进行这种类型的神经元中的superecliptic pHluorin标签DRD2s TIRF成像。 图3示出的表达pHluorin标签多巴胺D2(pH值-DRD2)在培养基中的多刺的pH-的DRD2插入在该神经元的神经元和可视化。

图1
图1。小鼠海马文化的使用界面培养法。 DIV: 体外日,这一天被认为是文化DIV 0。从图像中,显而易见的是,在这种类型的文化之间的DIV 11和15 DI​​V成熟的海马神经元。在11和13的DIV,神经元树突与filipodia和未成熟棘覆盖。在DIV 1518,神经元树突覆盖着大刺,显示更成熟的神经元。左图:低倍率的图像在不同年龄的小鼠海马神经元。右图:高倍率的图像变焦在左侧面板中的神经元树突的神经元树突,树突棘在不同的年龄。

图2
图2。鼠标纹状体中等多刺的神经元培养使用接口的培养方法。在图像的神经元在DIV 8。

图3
图3:鼠标纹状体中多刺的神经元转染超黄道pHluorin标记多巴胺D2受体(PH-DRD2)。图片的左边是随时间推移记录的最大强度投影(600个图像,100毫秒每幅图像)。白色箭头指示个人水泡的pH-D插入RD2。此图片保留在xy尺寸的插入信息,但失去的时间信息。在右边的图像示出YT最大强度投影,在其中的XYT堆栈围绕y-轴旋转90度,并在每个x轴的线中的最大像素被投射到一个单一的y轴像素。此图像保留沿YT轴插入信息,但失去了x轴信息。

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Discussion

不知什么原因,小鼠神经元总是很难培养的大鼠神经元。在我们的经验中,混合培养的神经元和神经胶质细胞的原代培养的小鼠神经元。然而,这样的混合培养TIRF成像实验是不适合的,在这种类型的培养的神经元和其流程往往顶部的神经胶质细胞上生长的情况,神经元的胞体和树突状进程鞭长莫及TIRF显微镜。因此,较低的密度盖玻片上少数神经胶质细胞的神经元培养TIRF成像的理想选择。我们首先测试的银行家方法19,20,种子在培养皿的底部与神经胶质细胞,神经元接种于盖玻片和上下颠倒放置在培养皿中。盖玻片和神经胶质细胞层由三个小滴蜡盖玻片上分离。这种方法非常适用于规模较小的的盖玻片(如15毫米或18毫米盖玻片),但是当我们测试使用的25毫米的合作verslips,神经元的中心附近的盖玻片盖玻片的边缘附近的健康。

虽然这两种不同的神经元健康原因我们不清楚,我们推测,这可能是由于有限的营养物质向中心的盖玻片区的扩散。因此,我们转向这个手稿中描述的界面培养方法,作为膜的培养插管允许自由扩散盖玻片上的神经元的营养。种子神经元上的25毫米盖玻片上,与神经元朝上。我们接种神经胶质细胞上的培养插管,并置于盖玻片上的神经胶质细胞馈线插入。我们确定的接口培养法优于其他方法,我们测试时使用25毫米盖玻片低密度小鼠神经元培养,TIRF成像产生一致的结果。为了量化受体插入的特性(频率,振幅),对照组与神经元的转染瓦特第i个野生pHluorin标记的受体。对照组,也可作为神经元培养的质量检查。

我们的TIRFM系统构造根据在手动的蔡司AxioObserver显微镜(卡尔·蔡司显微成像公司,索恩伍德,NY)。激发激光器是一种新港488-100mW的青色激光系统(Newport公司,欧文,CA)。 经由 KineFLEX-P-2-S-488-640-0.7-FCP-P2光纤(点源,米切尔点,汉布尔英国)的激光被耦合到一个蔡司TIRF滑块。一个Z488RDC分色镜(色度科技股份有限公司,波纹管瀑布,VT),以反映入射的激光到了蔡司α-100X物镜(NA = 1.46,卡尔·蔡司)计划。一种ET525/50发射滤光片(色度科技公司)被用于GFP荧光检测。进化EMCCD相机(配光曲线,图森,亚利桑那州)被用来作为检测器。 2.5倍中继透镜显微镜的相机端口和凸轮之间的插入时代,为了实现最佳的空间分辨率(0.064微米时,每个像素使用100X NA = 1.46物镜)。相机被保持在-80℃下,在成像过程中的实验。一个Uniblitz LS6的VMM-D3控制器(文森特,在纽约州罗切斯特)的快门控制集成之间的激光头,光纤发射器。数据被收购使用μManager软件( http://www.micro manager.org / )。

所有成像实验,在人工脑脊液含有2mM CaCl 2的溶液在37℃下进行。此的人工脑脊液溶液调节至pH = 7.4,在室温下。当加热到37℃,此人工脑脊液的pH变为7.2,它是在培养的神经元的最佳选择。在采集过程中,激光功率设定为最大,无论是光漂白和数据采集。相机曝光被设定为100毫秒,和采集速率是每秒10张影像(10赫兹)。 EMCCD的增益设置T最大。录音进行了分析,用ImageJ软件(罗斯本,WS,美国国立卫生研究院, http://rsb.info.nih.gov/ij/ ,1997年至2012年),和,插入注册事件手动和分析。被作为插入的频率,每分钟每单位表面积的事件的总数,并归一化到对照组为100%。 YT渲染的图像中产生的ImageJ的沿y轴通过旋转原始XYT叠层90°,每一x线投射到使用ImageJ的最大强度投影算法在y轴的单个像素的最大强度。

插入事件通常观察到突然出现的荧光蓬(快速上升阶段),其次是一个腐朽的阶段,在质膜上的受体扩散7 9。一个缓慢的上升阶段,没有明显的衰减阶段出现的荧光蓬(突然disappearance)被排除在数据分析,这些事件可能代表有一个酸性较低的腔(如那些从内质网)的细胞内小泡,贩卖。光漂白剂的预先存在表面受体的人口将减少预先存在于质膜表面的受体聚簇的贡献。至目前为止,我们所有的数据进行分析手动使用ImageJ。计算机算法自动事件检测和数据分析的未来发展将是重要的促进适应和应用,这种成像方法检查的受体插入到质膜。

为了形象化pHluorin标记受体的单个的水泡插入事件,需要加以考虑的几个重要参数。首先,激光的激发需要是强大到足以使单泡的荧光检测。在我们的定制设计的系统中,我们采用了10 0-mW的488 nm激光作为我们的激励源。其次,检测器的成像系统需要具有的灵敏度和速度以获取数据,从实时,动态受体的插入。由于这些原因,我们在我们的系统中使用的EMCCD。强烈的激发激光器和EMCCD探测器相结合,我们的成像系统,提供单的GFP分子检测能力。我们选择定制设计的TIRF系统的基础上实现有限的资源发挥最大的性能。值得一提的是,市面上任何TIRF系统有足够的激光激发功率(100 mW的488 nm激光是足以满足我们的目的,是很容易在大多数商业平台)和EMCCD相机应该也适合这种成像的研究。因此,适应这种成像研究神经元不限TIRFM技术系统的性能,但由培养的神经元的神经元培养和一致性的质量。

ove_content“>第三,由于现有pHluorin标记的细胞膜受体,的TIRF模式下的光漂白剂通常是必要的从一个单一的囊泡的荧光的检测。我们通常最大使用TIRF成像模式进行1分钟的光漂白剂的初始荧光一次视觉上识别一个神经元的激光功率,这导致消除大多数预先存在的表面pHluorin荧光。同样重要的是要记住,高的激光激发功率激光损伤和光毒性的可能性也增加,根据我们的经验,使用一个100毫瓦488-mW的激光作为激发光源不出现引入明显的损伤的神经元内的数据采集期间,同时提供足够的激光功率的可视化在单囊泡受体。另外一个重要的考虑是,在差异在每个囊泡受体的类型和数量的,也将影响激光激发要求。例如,我们能够检查GluA1谷氨酸受体的调节亚基插入到质膜使用一个50兆瓦的激光激发。我们估计,在这项研究中研究包含每泡56±6 GluA1分子,类似的估计由另一组使用类似的方法,12。在最近的研究中,DRD2,我们估计,每泡30±1分子,和一个100兆瓦的激光是足够了这项研究。然而,在活细胞中,考试的囊泡包含只有几个受体分子(例如,5-10)可能需要高于100毫瓦的激光功率,以达到足够的信号到的背景噪声电平,因为高噪声比为插入受体在神经元的细胞膜中的可视化。找到正确的平衡灵敏度和励磁电源规划成功的学习是非常重要的。

到i TIRFM技术使用:法师superecliptic pHluorin标记的受体已被应用到几种不同类型的神经元受体7-17。然而,这是非常重要的是要记住,我们目前的方法依赖于标记的受体分子标记受体过度表达与GFP。附加GFP分子的膜蛋白的胞外结构域,可能会干扰与蛋白质的功能,并因此,这是至关重要的验证,这标记策略并显着干扰的功能的蛋白质根据调查9。此外,过度表达的受体可能会或可能不会受到监管的管理机制,贩运内源性受体。因此,需要独立的方法来验证结果成像过度表达pHluorin标记的受体。例如,在我们的研究GluA1插入,被表面内源性GluA1受体的表达和突触贩运的验证ü唱标准的免疫/生化方法,或电的方法。总之,我们的成像方法,与其他膜蛋白贩运的标准方法相结合,很可能是在解剖详细的管插入质膜的其他膜蛋白在神经元的细胞和分子机制。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是从杰克逊实验室的启动资金支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
purified bovine collagen solution (Purecol) Advanced Biomatrix 5005-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14185-045
penicillin-streptomycin (Pen Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
sodium pyruvate GIBCO, by Life Technologies 11360-070
DMEM High Glucose GIBCO, by Life Technologies 10313-021
fetal bovine serum (FBS)
GlutaMAX GIBCO, by Life Technologies 35050-061
papain Worthington Biochemical Corp. LS003126
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) Sigma-Aldrich DN25-10MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
0.05% trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300-054
poly-l-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P2636-1G
boric acid Fisher Scientific BP 168-500
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103-049
B-27 Serum-Free Supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
heat inactive horse serum GIBCO, by Life Technologies 26050-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668 019
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Culture Insert EMD Millipore PICM03050

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References

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Comments

1 Comment

  1. I want to get a copy of this video,who can help me?

    Reply
    Posted by: zhang j.
    June 16, 2014 - 9:59 AM

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