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냉동 건조 된 감자 괴경 샘플의 신속한 높은 처리량 아밀로스 결정

Chemistry

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Summary

이 프로토콜은 요오드와 녹말 포도당 분자 사슬 사이의 복잡한의 형성에 의존 넣어 비색법을 통해 고 설명합니다. 요오드는 아밀로스와 아밀로펙틴 내 긴 사슬 모두와 복합체를 형성한다. 전분 시료에 요오드를 첨가 한 후, 아밀로오스와 아밀로펙틴의 최대 흡수는 각각 620 및 550 nm에서 발생한다. 아밀로스 / 아밀로펙틴의 비율은 620 및 550 nm의 흡광도 값의 비율을 추정하고 특정한 알려진 농도는 흡수 값에 대해 도시 된 표준 곡선에 비교를 할 수있다. 이것은 높은 처리량은, 저렴 방법은 감자 클론의 많은 개체군의 평가를 허용 신뢰성과 재현성이다.

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Fajardo, D., Jayanty, S. S., Jansky, S. H. Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples. J. Vis. Exp. (80), e50407, doi:10.3791/50407 (2013).

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Abstract

이 프로토콜은 요오드와 녹말 포도당 분자 사슬 사이의 복잡한의 형성에 의존 넣어 비색법을 통해 고 설명합니다. 요오드는 아밀로스와 아밀로펙틴 내 긴 사슬 모두와 복합체를 형성한다. 전분 시료에 요오드를 첨가 한 후, 아밀로오스와 아밀로펙틴의 최대 흡수는 각각 620 및 550 nm에서 발생한다. 아밀로스 / 아밀로펙틴의 비율은 620 및 550 nm의 흡광도 값의 비율을 추정하고 특정한 알려진 농도는 흡수 값에 대해 도시 된 표준 곡선에 비교를 할 수있다. 이것은 높은 처리량은, 저렴 방법은 감자 클론의 많은 개체군의 평가를 허용 신뢰성과 재현성이다.

Introduction

감자 괴경의 신선한 무게의 약 80 %가 물이며, 거의 모든 남아있는 건조 물질의 전분 1입니다. 나머지 동안 아밀로스 전분 (70 %)의 대부분은, 아밀로펙틴으로 구성된다. 아밀로스와 아밀로펙틴의 비율은 전분의 물성을 좌우하는 가장 중요한 속성이다. 아밀로펙틴 알파 1-6 분기 2 선형 알파 1-4 체인 동안 아밀로스는 선형 알파 1-4 포도당 체인입니다. 요오드 등의 방법 바인딩, 시차 주사 열량계 (DSC)는, 고성능 크기 배제 크로마토 그래피 (HPSEC) 및 콘 카나 발린의 상호 작용은 다양한 작물 3,4 전분 판별을 위해 개발되었다. 각 프로토콜은 어려운 한 번에 다수의 샘플을 계량하는 확장 할 만드는 특별한 기술과 장비가 필요합니다. 우리가 여기서 제시하는 방법은 바인딩 듀얼 파장 요오드 Hovenkamp-Hermelink 등. 5에서 수정 된 프로토콜입니다스테인드 전분 과립에 따라 방법. 다른 대이 방법의 장점은 정제하지 않고 원료 전분 아밀로스 판별 및 메서드 4,6의 정밀도를 높이기 위해 이중 파장 시스템의 사용을 포함한다.

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Protocol

1. 감자 덩이 식물의 전분에서 아밀로오스 결정

  1. 껍질과 작은 큐브로 신선한 덩이 줄기를 잘라.
  2. 작은 갈색 봉투에 감자 큐브를 놓고 C. -80 °에서 하룻밤 저장
  3. 나일론 가방과 동결 건조 감자 조각을 전송합니다.
  4. 동결 건조 후, 박격포와 유 봉 또는 와일리 밀을 사용하여 분말로 감자 샘플을 갈기.
  5. 50 ㎖ 튜브에, 동결 건조, 지상 괴경 20-30 mg의 샘플을 추가한다.
  6. 45 %의 솔루션을 준비합니다 (w / v)의 과염소산 (60 % 과염소산 24.4 ㎖ 및 초순수 25.6 ㎖를 혼합한다.
  7. 45 %의 500 μL (w / v)의 과염소산을 추가하고 흔들거나 전분 과립을 분산 할 소용돌이 친다.
  8. 실온에서 네 분 배양 기간 후, 용액을 초순수 16 ㎖를 추가하고 텍싱하여 혼합한다.
  9. 비 수용성 물질이 튜브 바닥에 침전 한 후 (7-10 분 이상), (마이크로 타이 터 플레이트에 용액 40 μl를 전송할모든 입자의 피펫 팅을 피하는).
  10. 요오드 용액 ​​(2g KI + 1g의 I 초순수 900 ㎖를 2)의 50 μl를 추가하고 피펫 팅하여 샘플을 섞는다.
  11. 550 nm에서 흡광도를 읽고 (620)는 즉시 nm의.
  12. 의 농도 범위에서 아밀로스 및 아밀로펙틴 해법에서 생성 표준 곡선과 각 샘플의 아밀로스 / 아밀로펙틴의 비율 (620 nm/550 nm의 흡광도)를 비교하여 아밀로스 비율을 결정한다. 이 절차는 다음에 설명 될 것이다. 테스트 샘플과 함께 빈 (요오드 용액과 과염소산)를 참조하십시오. 사용 분석을위한 데이터를 숨겨진.

2. 아밀로스 / 아밀로펙틴 곡선

  1. 별도의 튜브에서 아밀로오스의 12.5 MG와 아밀로펙틴의 12.5 mg의 무게.
  2. 45 %의 각 튜브 5 ㎖에 추가 (W / V) 과염소산 완전히 용해.
  3. 솔루션 (아밀로오스 및 아밀로펙틴) 각각에 대해 초순수 50 ㎖의 최종 부피로 가져온다.
  4. 6.25 혼합20,625 ML 초순수 사용하여 이전 단계에서 아밀로오스 주식의 ML. 이것은 6.25 ㎎ / ㎖의 아밀로스 솔루션을 만들 것입니다.
  5. 아밀로펙틴 솔루션에 대해이 절차를 반복합니다.
  6. 단계 2.4 및 2.5에서 아밀로스 및 아밀로펙틴 표준 용액을 사용하여, 10 % 간격의 표준 곡선을 생성하기 위해 5 ㎖의 최종 부피로 0 ~ 100 %의 아밀로오스 (100~0% 아밀로펙틴) 아르 %의 아밀로스 표준 제조.
    예를 들어, 제조 하였다 :
    0 % 아밀로오스 / 100 % 아밀로펙틴 표준 피펫 5 ㎖ 아밀로펙틴 솔루션입니다.
    10 %의 아밀로스 / 90 % 아밀로펙틴 표준은 0.5 ㎖ 아밀로스와 아밀로펙틴의 4.5 ml의 용액을 배합.
    20 %의 아밀로스 / 80 % 아밀로펙틴 표준은 1.0 ml의 아밀로스와 아밀로펙틴의 4.0 ml의 용액을 배합.
    30 % 아밀로오스 / 70 % 아밀로펙틴 표준은 1.5 ml의 아밀로오스와 아밀로펙틴 3.5 ml의 솔루션을 결합한다.
    40 %의 아밀로오스 / 60 % 아밀로펙틴 표준은 2.0 ml의 아밀로오스와 아밀로펙틴 2.0 ml의 솔루션을 결합한다.
    50 %의 아밀로오스/ 50 % 아밀로펙틴 표준, 2.5 ml의 아밀로오스와 아밀로펙틴 2.5 ml의 솔루션을 결합한다.
    60 %의 아밀로스 / 40 % 아밀로펙틴 표준은 3.0 ml의 아밀로스 및 아밀로펙틴을 2.0 ㎖의 결합 등).
  7. 마이크로 플레이트에 각각의 표준 혼합물의 40 μl를 전송합니다. 빈으로 잘 40 ㎕의 45 %와 (w / v)의 과염소산 (가) 있습니다.
  8. 요오드 용액 ​​(2g KI + 1g의 I 초순수 900 ㎖를 2)의 50 μl를 추가하고 피펫으로 (공백 포함) 각 샘플을 섞는다.
  9. 550 nm에서 흡광도를 읽고 (620)는 즉시 nm의 각 농도에 대한 아밀로오스 / 아밀로펙틴의 비율을 계산합니다.

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Representative Results

다른 아밀로오스 / 아밀로펙틴 농도 솔루션의 숨겨진 데이터를 구축 표준 곡선은 0.7에서 1.6 (표 1)에 이르기까지 약 흡수 비율을 보여줍니다. 이러한 데이터로부터 선형 회귀 추세선 나중에 동결 건조 감자 샘플 아밀로스 함량 (도 1)를 추론하는 데 사용된다.

공장의 생산 환경은 감자 괴경 7 아밀로스 함량에 대한 몇 가지 효과가 있습니다. 두 개의 필드 위치에 복제 된 아밀로스 함량의 결정은 감자 괴경 중 하위 변화 (표 2)를 보여 주었다. 색깔의 고기 감자 안료는 아밀로스 결정 분석에 영향을 미칠 것 같지 않습니다.

% 아밀로스 솔루션 1 550 nm의 흡광도 620 nm의 흡광도 비율이 620 nm/550 NM
0 0.223 0.156 0.700
10 0.225 0.181 0.804
(20) 0.221 0.203 0.919
(30) 0.220 0.219 0.995
(40) 0.223 0.246 1.103
(60) 0.216 0.280 1.296
(70) 0.231 0.319 1.381
90 0.225 0.347 1.542
(100) 0.219 0.357 1.630

%의 아밀로오스 대 아밀로오스 농도와 흡광도 비 (620 nm/550 NM) 사이의 표 1. 관계. 흡광도 비율은 그림 1에서 <꾸몄다아밀로오스 결정 1> / 강한. 백분율 아밀로스 용액은 농도가 다른 2에서 아밀로오스와 아밀로펙틴의 주식 솔루션에서 만들어졌다. 숨겨진 데이터에서 계산 된 비율은 620 ㎚, 550 ㎚에서 흡광도.

품종 LOC 550 nm의 620 nm의 아밀로스 %
애디 론댁 블루 1 1.86 1.78 0.955 25.5
2 2.28 2.15 0.946 24.4
초기 로즈 1 2.17 2.12 0.977 27.8
2 2.22 2.14 0.967 26.7
FRE에돔 황갈색 1 1.99 1.92 0.965 26.5
2 1.98 1.93 0.973 27.4
잉카 골드 1 1.95 2.00 1.021 32.6
2 2.27 2.28 1.004 30.7
레인저 황갈색 1 1.88 1.84 0.975 27.6
2 2.15 2.08 0.967 26.7
황갈색 Norkotah 1 1.84 1.79 0.972 27.3
2 1.90 1.86 0.975 27.6
스노 덴 1 2.23 2.13 0.956 25.5
2 1.64 1.61 0.979 28.0
화이트 펄 1 2.32 2.28 0.986 28.7
2 2.22 2.18 0.983 28.5

표 2. 두 개의 서로 다른 분야의 생산 위치 (은 Loc)에서 감자 품종의 아밀로스 함량의 복제 평가.

그림 1
그림 1. 아밀로스 농도 표준 곡선은 감자 괴경에서 아밀로스 %의 내용을 추론하는 데 사용됩니다.

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Discussion

감자 괴경의 아밀로스 함량은 일반적으로 20 ~ 35 % 7,8 범위. 가장 값이 범위를 벗어나는 경우, 이러한 오류 가능성 고려 : 1) 원시 데이터가 아밀로오스 / 아밀로펙틴 표준 곡선의 건설 대신 숨겨진 데이터를 사용했다가, 2) 원시 데이터는 아밀로오스의 결정 대신에 숨겨진 데이터를 사용 하였다 / 아밀로펙틴 감자 샘플에서 비율, 또는 3) 해석에 사용하는 물이 충분히 순수하지 않았다. 우리는 분석 증류수하지 초순수를 사용하여, 얻어진 값은 재현되지 않은 것을 알아 차렸다. 여전히 사용하기에 너무 오래된 경우 요오드 용액이 제대로 준비 나되어 있는지 확인하는 쉬운 방법은 550 nm에서 빈 샘플의 원시 흡광도 값이 0.1 정도인지 여부를 확인하는 것입니다.

요오드와 아밀로펙틴 / 아밀로스 용액의 제조시 정밀도 안심 아밀로스 결정을 얻는 데 중요하다. 우리는 에이미의 비율을 결정하고 있기 때문에오히려 감자 전분의 아밀 로즈의 정확한 양보다 콘텐츠를 잃고, 다른 판정 방법에 의해 제시된 감자 분말 순수한 전분의 분리에 대해 어떠한 정제 단계가 없다.

감자 품종의 아밀로오스 함량의 측정을 위해, 각 품종에서 두 개의 독립적 인 동결 건조 괴경은 각 지역에서 처리 하였다. 우리는 감자 괴경과 아밀로스 함량의 변화가 (보다 1 % 포인트) 작고 중요하지 것으로 나타났습니다.

아밀로스 함량 결정의 차이로 인해 20 ~ 30 mg의 사이에 감자 전분의 초기 금액에 없었다. 이 범위를 벗어나는 결과는 우리의 플레이트 리더로 ​​신뢰할 수 없거나 탐지되었다. Hovenkamp-Hermelink 외. 5 샘플이 너무 집중되는 경우 물의 볼륨을 추가 제안하더라도, 우리는 샘플을 reweighing과 동일한 방법 추천합니다.

이 연구의 prese흰색 구체화 감자에 따라 국세청 데이터. 또한, 우리는 색깔의 고기 감자 (노란색, 빨간색과 보라색)과이 방법을 평가했다. 요오드 / 아밀로오스 복합체와 간섭이 검출되지 않았다. 그러나, 요오드 결합 분석에서와 같이, 아밀로오스의 비율 인해 아밀로펙틴 분자의 직선 사슬을 요오드의 결합에 다소 과대 평가 될 가능성이있다. 이 분석은 샘플의 큰 숫자를 심사하기위한 것입니다. 일단 높은 아밀로오스 개인이 식별, 우리는 9,10 콘 카나 발린 등의 아밀 로즈 별 분석, 재 테스트를 권장합니다. 이 분석은 더 비싸고 노동 집약적 요오드 결합 분석법 이상이지만,보다 정확하게 아밀로스 수준을 결정한다.

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Disclosures

우리는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgements

이 연구를위한 자금 조달은 USDA-ARS 연구원 프로그램 및 USDA 작물 유전자 원위원회에 의해 부분적으로 제공되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Amylose Sigma 859656
Amylopectin Sigma A8515
Perchloric Acid 60% Sigma 311413 Very hazardous to skin and eyes
Iodine Sigma 23214TD
Potassium iodide Sigma 08625JE
Equipment
Plate Reader Bio Tek ELx800

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References

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