संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए लिपिड झिल्ली में एक केवी चैनल का पुनर्गठन

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

लिपिड झिल्ली में एक प्रोटोटाइप वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल की पूरी पुनर्गठन के लिए प्रक्रिया वर्णित हैं. पुनर्गठन चैनलों जैव रासायनिक assays, बिजली रिकॉर्डिंग, ligand के स्क्रीनिंग और इलेक्ट्रॉन crystallographic पढ़ाई के लिए उपयुक्त हैं. इन विधियों अन्य झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए सामान्य आवेदन कर सकते हैं.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. J. Vis. Exp. (77), e50436, doi:10.3791/50436 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

एक reductionistic फैशन में लिपिड, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए, यह अच्छी तरह से परिभाषित लिपिड रचना की झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन को शामिल करने के लिए आवश्यक है. हम एक प्रोटोटाइप वोल्टेज gated पोटेशियम (केवी) चैनल में लिपिड निर्भर gating के प्रभावों का अध्ययन कर रहे हैं, और विभिन्न झिल्ली सिस्टम में पुनर्गठित चैनलों के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं बाहर काम किया है. हमारी पुनर्गठन प्रक्रियाओं डिटर्जेंट प्रेरित पुटिका के विलय और प्रोटीन / डिटर्जेंट लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रित मिसेलस साथ मिसेलस के साथ ही प्रोटीन / डिटर्जेंट / लिपिड और डिटर्जेंट में लिपिड का एक संतुलन वितरण तक पहुँचने के महत्व के विलय दोनों का ध्यान रखना / लिपिड मिश्रित मिसेलस. हमारे डेटा लिपिड vesicles में चैनलों की प्रविष्टि झुकाव में अपेक्षाकृत यादृच्छिक सुझाव दिया है कि, और पुनर्गठन दक्षता कोई detectable प्रोटीन समुच्चय fractionation के प्रयोगों में देखा गया है कि इतनी अधिक है. हम पुनर्गठन का उपयोग किया हैअलग लिपिड में चैनलों के गठनात्मक राज्यों निर्धारित करने के लिए घ चैनलों, तलीय लिपिड bilayers में शामिल चैनलों की एक छोटी संख्या, एक फेज प्रदर्शित पेप्टाइड पुस्तकालय से रचना विशिष्ट ligands के लिए स्क्रीन के बिजली गतिविधियों को रिकॉर्ड, और 2 डी क्रिस्टल के विकास का समर्थन झिल्ली में चैनलों की. यहाँ वर्णित पुनर्गठन प्रक्रियाओं खासकर यूकेरियोटिक वोल्टेज gated आयन चैनल पर लिपिड प्रभाव की जांच के लिए, लिपिड bilayers में अन्य झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

प्रकोष्ठों विनिमय सामग्री और विशिष्ट झिल्ली प्रोटीन 1 के कार्यों के माध्यम से अपने पर्यावरण के साथ जानकारी. कोशिका झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन पंप, चैनल, रिसेप्टर्स, intramembrane एंजाइमों, linkers और झिल्ली में संरचनात्मक समर्थकों के रूप में कार्य करते हैं. झिल्ली प्रोटीन प्रभावित म्यूटेशनों कि कई मानव रोगों से संबंधित कर दिया गया है. वे महत्वपूर्ण और कोशिका झिल्लियों में आसानी से उपलब्ध हैं क्योंकि वास्तव में, कई झिल्ली प्रोटीन प्राथमिक दवा लक्ष्य दिया गया है. यह झिल्ली में विभिन्न झिल्ली प्रोटीन की संरचना और समारोह को समझते हैं, और यह संभव मानव रोगों में उत्परिवर्ती प्रोटीन से हानिकारक प्रभाव को कम करने के तरीकों उपन्यास वसीयत करने के लिए बनाने के लिए इसलिए बहुत महत्वपूर्ण है.

लिपिड bilayers 2, 3 में एकीकृत सभी झिल्ली प्रोटीन के चारों ओर. यूकेरियोटिक झिल्ली में, लिपिड के विभिन्न विभिन्न प्रकार microdomains 4, 5 में संगठित होने के लिए जाना जाता है.कई झिल्ली प्रोटीन इन microdomains के साथ ही झिल्ली 3, 6 की भारी तरल पदार्थ चरण के बीच वितरित किया जाना दिखाया गया. microdomains और झिल्ली प्रोटीन का वितरण उन में और इस तरह के वितरण के शारीरिक महत्व के संगठन अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट रूप से महत्वपूर्ण हैं, लेकिन खराब समझ रहते हैं. झिल्ली प्रोटीन पर लिपिड प्रभाव का अध्ययन करने में एक प्रमुख तकनीकी कठिनाई लगभग सभी पुनर्गठन प्रोटीन कार्यात्मक 7 रहे हैं कि इतना biochemically अच्छी तरह से नियंत्रित लिपिड रचना की झिल्ली में झिल्ली प्रोटीन शुद्ध विश्वसनीय पुनर्गठन है. पिछले कुछ वर्षों में, हम पुनर्गठित करने के लिए से प्रोटोटाइप वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल तरीके विकसित संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन 8-10 के लिए विभिन्न झिल्ली सिस्टम में Pernix (KvAP). दूसरों से डेटा और हमें एक साथ लिपिड संभावना वोल्टेज संवेदन के गठनात्मक परिवर्तन में एक निर्धारक हैं कि पता चलाएक वोल्टेज gated आयन चैनल और के डोमेन इन चैनलों के 11 में से कुछ के ढांचे को आकार कर सकते हैं. अगले में, हम हमारे तरीके का विस्तृत विवरण प्रदान करेगा और संभावना है कि हमारे परिणाम के सफल प्रजनन के साथ ही अन्य झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए हमारे तरीके का विस्तार सुनिश्चित करेंगे कि महत्वपूर्ण तकनीकी सुझावों की पेशकश करेगा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. अभिव्यक्ति और KvAP चैनल का शोधन (चित्रा 1)

  1. तैयारी कार्य - दिवस 0
    1. सामान्य dishwashing से डिटर्जेंट के निशान को हटाने के लिए विआयनीकृत पानी (Dih 2 हे) और MilliQ एच 2 ओ (MQH 2 हे) के साथ जीवाणु संस्कृति के लिए कांच की बोतल कुल्ला.
    2. 2.8 एल Erlenmeyer बोतल में आटोक्लेव 1000 मिलीलीटर लेग मध्यम (कुल दो लीटर यहाँ एक उदाहरण के रूप में संस्कृति). पानी की कम कठोरता तब्दील बैक्टीरिया के सफल संस्कृति के लिए महत्वपूर्ण हो पाया था.
    3. 500 मिलीलीटर बोतल में आटोक्लेव 100 मिलीलीटर लेग मध्यम
    4. के 200 एनजी के साथ XL1 ब्लू सक्षम कोशिकाओं के 60 μl रूपांतरण pQE60 प्लाज्मिड / 100 ग्राम वाले दो लेग अगर प्लेटों पर अपने सी टर्मिनस, प्लेट बैक्टीरिया पर एक थ्रोम्बिन काटने साइट और एक उनके 6 टैग के साथ KvAP के लिए जीन युक्त मिलीलीटर एम्पीसिलीन, और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 14-16 घंटे के लिए उन्हें सेते हैं.
  2. KvAP की अभिव्यक्ति - दिन 1
    1. अनुप्रयोग की जाँचरात ऊष्मायन के बाद प्लेटों पर बैक्टीरियल कालोनियों के earance. कालोनियों आमतौर पर व्यास में केवल बारे में 0.2-0.5 मिमी थे, और उनमें से एक बहुत थे. हम उपग्रह कालोनियों का एक बहुत से घिरा बड़ी कालोनियों बंदरगाह प्लेटें कि नहीं करना चाहती.
    2. रातोंरात incubated प्रत्येक लेग अगर प्लेट को 5.0 मिलीलीटर लेग मध्यम जोड़ें और कालोनियों बंद स्क्रैप. एक 500 मिलीलीटर कुप्पी में autoclaved 100 मिलीलीटर लेग माध्यम में बैक्टीरिया निलंबन स्थानांतरण. 100 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एम्पीसिलीन जोड़ें, 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 1 घंटे के लिए छोटे संस्कृति सेते या OD600 तक 0.60 तक पहुँचता है.
    3. इस बीच, जगह में एक 37 में 1.0 एल माध्यम के साथ दो बोतल डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर मध्यम गर्म अप, और BaCl 2 (1.0 एम, प्रत्येक 1.0 एल संस्कृति में 10 मिमी अंतिम एकाग्रता) का 20 मिलीलीटर तैयार करने के लिए मिलाते हुए, 2.0 मिलीलीटर 0.4 एम IPTG (आइसोप्रोपिल-Thio-β-galactoside), और पानी में 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन स्टॉक के 2.0 मिलीलीटर.
    4. छोटे संस्कृति के लिए तैयार है, एक बार, ampici की 1.0 मिलीलीटर BaCl 2 की 10 मिलीलीटर जोड़ेंकदम 1.2.2 से पूर्व गर्म लेग मीडिया के लिए छोटे संस्कृति के LLIN स्टॉक, और 50 मिलीलीटर. OD600 0.05 के आसपास होना चाहिए. पानी की उच्च कठोरता और लेग मीडिया में काउंटर आयनों के कारण संभव वर्षा के लिए देखो. बा 2 पोटेशियम चैनल और ब्लॉक ईओण वर्तमान के ध्यान में लीन होना डोमेन के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता है, और इस प्रकार के जीवाणु के लिए चैनलों के उच्च स्तर अभिव्यक्ति की विषाक्तता कम हो जाती है.
    5. यह 0.9-0.8 तक पहुँच जाता है जब तक यह 0.70 पहुँचता है, और हर पंद्रह मिनट तक हर घंटे OD600 लो. हमारे में सेट अप, यह आमतौर पर 0.8 तक पहुँचने के लिए ~ 5 घंटे लगते हैं.
    6. चैनल प्रोटीन से प्रेरित अभिव्यक्ति शुरू, और मिलाते हुए 225 आरपीएम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 4.0 घंटे के लिए संस्कृति सेते IPTG 0.40 मिमी जोड़ें.
    7. हार्वेस्ट 15 मिनट के लिए 4000 XG, 4.0 डिग्री सेल्सियस पर कताई द्वारा 1.0-लीटर अपकेंद्रित्र बोतलों में बैक्टीरिया. बर्बादी बीकर में जितना संभव तैरनेवाला छानना, सभी बा 2 वेग से 10 मिलीलीटर 1.0 एम ना फास्फेट बफर जोड़ने +, और फिर एक जोड़बैक्टीरिया को मारने के लिए ब्लीच की थोड़ी मात्रा. रात में एक 4.0 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में बर्फ में दफन अपकेंद्रित्र बोतलों में काटा बैक्टीरिया रखें.
  3. KvAP प्रोटीन का शुद्धीकरण (2 दिन और 3, चित्रा 1 बी)
    1. 1.0 एल संस्कृति प्रति IMAC lysis बफर के 15 मिलीलीटर में बैक्टीरिया गोली Resuspend. ~ 1.0 यू DNase मैं, और leupeptin के तीन protease inhibitors, aprotinin और 1.0 ग्राम / एमएल pepstatin एक जोड़ें. दो लीटर संस्कृति के लिए कुल मात्रा ~ 35 मिलीलीटर था.
    2. पर समय के कुल 10 मिनट के लिए बर्फ में दबे एक धातु बीकर में resuspended बैक्टीरिया Sonicate. microprobe sonicator एक 4.0 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में एक 40% बिजली उत्पादन के साथ चक्र रवाना / 10 सेकंड पर एक 5 सेकंड में स्थापित किया गया था. जीवाणुओं का सबसे समाधान में ज्यादा हीटिंग के बिना lysed गया है ताकि बिजली उत्पादन की स्थापना के अनुभव से निर्धारित किया गया था.
    3. Sonicated सेल lysate के लिए शुष्क पाउडर में और 3 के लिए मिश्रण सेते हैं, n-decyl-β-डी Maltoside (Anatrace से सोल ग्रेड डीएम) की 0.50 ग्राम जोड़ेंनिरंतर क्षैतिज झटकों (~ 100 आरपीएम) के रूप में संभव के रूप में ज्यादा चैनल प्रोटीन निकालने के क्रम में साथ कमरे के तापमान (आर टी) पर .5 घंटा. यह डिटर्जेंट पाउडर पूरी तरह से 30-50 मिनट की अवधि में भंग कर रहा है कि यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है.
    4. डिटर्जेंट निकासी के बाद, आरटी पर 30 मिनट के लिए 20,000 XG पर centrifugation द्वारा lysate से सेल मलबे को हटा दें. खत्म करने के लिए centrifugation के लिए इंतजार करते हुए, बॉक्स 1 में विस्तृत रूप में उनकी टैग आधारित नियंत्रण रेखा (कम दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी) स्तंभ तैयार करते हैं.
    5. 1-2 एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से प्रेरित है कि मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर पूर्व पैक IMAC (मैं मीटर etal आयन एक ffinity hromatography mmobilized) स्तंभ पर कदम 1.3.4 से सतह पर तैरनेवाला लोड. वैकल्पिक रूप से निकाले उनकी टैग प्रोटीन batchwise बाइंडिंग के लिए IMAC राल के साथ incubated किया जा सकता है.
    6. IMAC धोने बफर के 5 बिस्तर संस्करणों चलाकर IMAC राल धो लें, और IMAC धोने शौकीन की 10 बिस्तर संस्करणोंएर प्लस 20 मिमी imidazole. एक में लाइन यूवी की निगरानी धोने साफ है कि सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
    7. 300 मिमी imidazole युक्त IMAC क्षालन बफर लगाने से KvAP प्रोटीन Elute. बाध्य KvAP के अधिकांश कॉलम के माध्यम से क्षालन बफर के 6 मिलीलीटर भीतर eluted है. जमा क्षालन भागों में थ्रोम्बिन (प्रोटीन की 2-3 मिग्रा प्रति 1.0 यू) जोड़ें और फोड़ना उनके 6 टैग को बेंच पर रात भर प्रोटीन सेते हैं.
    8. अगले दिन, में थ्रोम्बिन पचा प्रोटीन समाधान ध्यान केंद्रित एक Centricon (MWCO = 30K) नीचे आकार अपवर्जन FPLC (उपवास प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी) के लिए 600 μl के लिए. Centrifugation के दौरान प्रोटीन एकत्रीकरण कम करने के लिए नमूना हर पांच मिनट मिश्रण. प्रोटीन ध्यान केंद्रित किया है के रूप में, झिल्ली फिल्टर पर स्थानीय एकाग्रता अधिक हो जाता है, और कभी कभी स्पष्ट सफेद अन्यथा फिल्टर झिल्ली रोकना सकता है कि precipitates हैं. इसके अलावा concentrator के निचले भाग में प्रोटीन की उच्च एकाग्रता (~ 5-10 मिलीग्राम / एमएल) एक माथे की ओर जाता हैnish है रंग और मिश्रण वास्तव में नमूना नुकसान को कम करने में मदद करता है.
    9. FPLC संतुलन बफर के साथ पूर्व equilibrated है कि एक Superdex 200 स्तंभ के माध्यम से केंद्रित KvAP चलाएँ. आमतौर पर 12.3 मिलीलीटर की एक प्रतिधारण की मात्रा के साथ डीएम elutes में tetrameric KvAP चैनल के शिखर. मोनोमेरिक KvAP की एक छोटी राशि है जो 13.6 के आसपास मिली, पर एक छोटे से पीछे चल पूंछ है. हम इस्तेमाल स्तंभ के शून्य 7.0 मिलीलीटर में है, और आमतौर पर नमूना बहुत कम KvAP प्रोटीन होता है जो शून्य, पर एक छोटे शिखर को जन्म देता है. imidazole क्षालन (~ 24 मिलीलीटर) के अंत में आता है. एक साथ KvAP tetramers युक्त भिन्न और नीचे 0.5 मिलीलीटर के लिए प्रोटीन समाधान ध्यान केंद्रित पूल. : यूआरएल, 280 एनएम [रेफरी 12 में KvAP के एक अनुमान के अनुसार विलुप्त होने गुणांक (खुशबूदार अवशेषों की संख्या के आधार पर गणना की गई जो ~ 1.2E-5.0 एम -1 सेमी -1) का उपयोग कर नमूने की एकाग्रता का निर्धारण जो http:// web.expasy.org / protparam /].
      कमरे के तापमान पर, डीएम में शुद्ध KvAP प्रोटीन की पर्याप्त नुकसान के बिना कम से कम एक सप्ताह के लिए स्थिर है. 4 ° C पर, यह भी अब पिछले सकता है. डिटर्जेंट में प्रोटीन फ्रीज कभी नहीं. यह 4 डिग्री सेल्सियस पर डीएम में प्रोटीन स्टोर करने के लिए सिफारिश की है, और कमरे के तापमान पर β-ओग में प्रोटीन है. लेकिन हम सामान्य रूप से इंतज़ार, और प्रोटीन के लिए तैयार हैं तुरंत बाद पुनर्गठन कदम के लिए आगे बढ़ना नहीं है.
    10. परख एसडीएस पृष्ठ जेल को कम करने के लिए एक 12% में नमूनों.
      ऊपर वर्णित हर कदम से नमूने 1.0% β-ME के साथ पूरक 5x एसडीएस नमूना बफर (buffers के लिए 3 टेबल) के साथ नमूनों में से 20 microliters के मिश्रण से तैयार किया गया. नमूने उबला हुआ नहीं थे. जैल तैयार थे बाद, नमूने आमतौर पर कमरे के तापमान पर अधिक से अधिक 10 मिनट के लिए एसडीएस बफर में किया गया था. जेल चलाने और Coomassie नीले रंग से सना हुआ था के बाद, जंगली प्रकार KvAP आसपास 26 केडीए (चित्रा 1 बी में एक बैंड के रूप में दिखाया

2. आयन चैनल पुनर्गठन

2.1. Vesicles के liposome तैयारी और डिटर्जेंट प्रेरित संलयन

लिपिड तैयार करने से पहले, एक 14 मिलीलीटर डिस्पोजेबल गिलास परखनली, एक पेंच से ढकी ग्लास ट्यूब, और क्लोरोफॉर्म के साथ एक 250 μl गिलास सिरिंज धो लो. TestTube में ~ 10 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म बाहर डालो.

  1. Palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-ethanolamine (पोप) और palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-ग्लिसरॉल (POPG) liposomes की तैयारी.
    1. पोप की 3.75 मिलीग्राम और POPG की 1.25 मिलीग्राम (पोप: POPG = 3:01 वजन अनुपात) स्थानांतरण से पूर्व साफ पेंच से ढकी कांच की नली में क्लोरोफॉर्म में और आर्गन गैस की एक सतत स्ट्रीम के तहत लिपिड सूखी. कोई दिखाई क्लोरोफॉर्म छोड़ दिया जाता है, तो एक घंटे के लिए कमरे में वैक्यूम के तहत आगे लिपिड सूखी.
    2. नमक का बफर कम के 440 μl (10 मिमी HEPES, 7.4 पीएच जोड़ें) या पानी सूख लिपिड और भंवर हाइड्रेट लिपिड के लिए ट्यूब में. लिपिड निलंबन श्वेताभ और परेशान लग रहा है.
    3. पुटिका समाधान (OD410 <0.2) पारदर्शी हो जाता है जब तक एक ठंडा स्नान sonicator में लिपिड निलंबन Sonicate.
      आमतौर पर पानी या कम नमक बफर में 10 मिलीग्राम / एमएल पोप / POPG समाधान के लिए, हम 15-20 मिनट की कुल के लिए 30 सेकंड पर और 30 सेकंड रवाना (बर्फ पर) के साथ sonicator संचालित. क्योंकि sonication के दौरान उत्पन्न गर्मी की, यह लिपिड ऑक्सीकरण को कम करने के लिए, और डिग्री सेल्सियस या नीचे 10 से sonicator का पानी स्नान शांत करने के क्रम में लिपिड समाधान में 1.0 मिमी डीटीटी जोड़ने की सलाह दी जाती है. अंतिम OD410 लिपिड पर निर्भर है. कुछ लिपिड के लिए यह इतनी कम आयुध डिपो तक पहुंचने के लिए बहुत मुश्किल हो सकता है. अगर ऐसा होता है, हम आम तौर पर पूरी तरह से लिपिड solubilize और लंबी ऊष्मायन प्रोटीन युक्त मिसेलस (अगले देखें) के आसपास लिपिड का अच्छा वितरण तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए डिटर्जेंट का उपयोग करें.
      एक उच्च क्षमता स्नान sonicator ord में महत्वपूर्ण हैएर OD410 <0.2 तक पहुँचने के लिए. हम प्रयोगशाला आपूर्ति कंपनी, इंक (मॉडल # G112SPIG, हिक्सविले, एनवाई) द्वारा किए गए एक प्रणाली का उपयोग किया गया है. vesicles के उचित sonication के लिए कुंजी ट्यूब के बीच में सुनाई देती केंद्र मजबूत कंपन है कि सुनिश्चित करने के लिए है. कंपन पानी की मात्रा के साथ बदलता रहता है और इसलिए समायोजित किया जा सकता है. इसके अलावा यह अनुभव से ग्लिसरॉल की एक छोटी राशि जोड़कर पानी की वृद्धि की चिपचिपाहट sonication के प्रभावकारिता को बढ़ाने कर सकते हैं पाया है.
      वैकल्पिक रूप से हम एक प्लास्टिक या धातु ट्यूब में लिपिड निलंबन के साथ संपर्क में एक microprobe sonicator का उपयोग कर एक ही परिणाम का उत्पादन कर सकते हैं कि मिल गया है. microprobe साफ करने की जरूरत है और केवल टिप लिपिड समाधान में विसर्जित है. लिपिड कणों microprobe की सतह पर छोटे टुकड़ों में टूट रहे हैं, क्योंकि यह नमूना ठंडा रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, और कुछ असंतृप्त वसा पदार्थ के ऑक्सीकरण रोकने के लिए चारों ओर एजेंटों को कम करने की है.
      क्रायो इलेक्ट्रॉन माइकर के तहतoscopy, sonicated unilamellar vesicles के बहुमत व्यास में 30-50 एनएम (नहीं दिखाया डेटा है) हैं. छोटी एसयूवी की वक्रता एक छोटे गड़बड़ी व्यास में 80-200 एनएम (अगले देखें) कर रहे हैं कि बड़े लोगों में इन vesicles के जीवंत संलयन प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है कि इतनी अधिक है.
    4. 3.0 एम KCl के 50 μl और अंतिम लिपिड निलंबन 300 मिमी KCl और डीएम 10 मिमी है ताकि मिश्रण को डीएम 0.50 एम के 10 μl जोड़ें. लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रित मिसेलस लिए फार्म आरटी पर 2 घंटे के लिए क्षैतिज रोटेशन के साथ समाधान सेते हैं. ऊष्मायन के बाद, निलंबन छोटे unilamellar vesicles के डिटर्जेंट प्रेरित संलयन की वजह से है जो एक छोटा सा पंकिल (2A चित्रा), हो जाना चाहिए.
    5. प्रोटीन से अधिक 2.0 करने के लिए ध्यान केंद्रित किया गया है, जब मिलीग्राम / एमएल, को लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रण करने के लिए 0.50 मिलीग्राम KvAP प्रोटीन, 3.0 एम KCl के 50 μl, पानी में 0.50 एम डीएम स्टॉक के 16 μl, और 10 मिमी HEPES, 7.4 पीएच जोड़ अंतिम मात्रा के 1 मिलीलीटर. अंतिम लिपिड: प्रोटीन वजन अनुपात 10:01 हैऔर डीएम के अंतिम एकाग्रता 18 मिमी (2A चित्रा) है. एक और 2 घंटे के लिए क्षैतिज रोटेशन के साथ ग्लास ट्यूब में प्रोटीन / लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रण सेते हैं.
      डिटर्जेंट एकाग्रता का चयन डिटर्जेंट प्रेरित पुटिका संलयन और पुटिका solubilization 13 द्वारा निर्देशित है. पुटिका मजबूत sonication द्वारा गठित कर रहे हैं, उनकी औसत व्यास ईएम तहत 30-50 एनएम की सीमा में है. इन vesicles 410 एनएम पर बहुत कम बिखरने है. कम मात्रा में, डिटर्जेंट पहले vesicles में डाला जाता है, पुटिका को अस्थिर करने, और डिटर्जेंट संतृप्त पुटिकाओं (OD410 ऊपर चला जाता है, 2A चित्रा देखें) के विलय को प्रेरित. पुटिका संलयन OD410 एनएम की वृद्धि हो जाती है. 10 मिलीग्राम / एमएल पोप / POPG vesicles के लिए, डीएम लगभग 15 मिमी पर OD410 चोटियों. अधिक डिटर्जेंट पेश कर रहे हैं, vesicles के टुकड़ों में तोड़ने के लिए और लिपिड डिटर्जेंट / लिपिड मिश्रित मिसेलस में विभाजित हो जाते हैं शुरू करते हैं. यह बाद की प्रक्रिया के साथ हैएक अंतिम निम्न स्तर (<0.1) के लिए नीचे OD410 की कमी.
      क्योंकि कारण छोटे vesicles के डिटर्जेंट प्रेरित संलयन के लिए ऑप्टिकल घनत्व की बढ़ती चरण में सक्रिय संलयन घटनाओं की, यह प्रोटीन / डिटर्जेंट मिसेलस सक्रिय डिटर्जेंट संतृप्त लिपिड vesicles के साथ जुड़े हुए किया जाएगा कि बहुत संभावना है. प्रोटीन / लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रण तैयार करने के समय डीएम 18 मिमी के चयन के पीछे कारण यही है. डिटर्जेंट 4 परतों से अधिक केंद्रित हो जाता है, डीएम की जरूरत की राशि अंतिम एकाग्रता 18-20 मिमी के आसपास अभी भी है कि इतनी समायोजित किया जाना है. प्रोटीन उपज बहुत कम है, यह केंद्रित डिटर्जेंट नमूने में हैं कितना मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल है, हम बजाय पूरी तरह solubilized लिपिड साथ प्रोटीन मिश्रण, और पुनर्गठन के लिए पूरी तरह से equilibrated मिश्रण का प्रयोग करेंगे. हमारे हाथ में नहीं पर्याप्त समय प्रोटीन युक्त और प्रोटीन से मुक्त मिसेलस, reconstitut बीच लिपिड का एक अच्छा संतुलन वितरण तक पहुँचने के लिए अनुमति दी गई थी तोआयन दक्षता काफी गिरा. हम आम तौर पर दो प्रयोगों द्वारा पुनर्गठन दक्षता परीक्षण: 1) एक sucrose के घनत्व ढाल ultracentrifugation में पुटिका अंश के साथ प्रोटीन की सह प्रवास की जांच, 2) एक में fractionate उन्हें पुनर्गठन vesicles के प्रोटीन को बाहर निकालने, और जेल (हमारे मामले में KvAP) tetrameric हो रहता कितना प्रोटीन को खोजने के लिए निस्पंदन स्तंभ. प्रोटीन / लिपिड / डिटर्जेंट के ऊष्मायन के न्यूनतम समय कमरे के तापमान पर या रातोंरात 4 डिग्री पर घंटे के एक जोड़े है.
      एक अलग डिटर्जेंट में स्थिर है कि एक नया झिल्ली प्रोटीन के लिए, पहला कदम 2A चित्रा में पता चला है क्या करने के लिए इसी तरह के एक डिटर्जेंट से लिपिड की solubilization संपत्ति, पता लगाने के लिए है. अगला, यह ऐसे ई. के रूप में पीसी अर्क, के साथ शुरू करने की सलाह दी जाती है विशिष्ट प्रोटीन अपने कार्य के लिए कुछ खास फॉस्फोलिपिड जरूरत है अगर कोलाई ध्रुवीय निकालने पीसी, सोयाबीन पीसी निकालने आदि, इसलिए, यह पहले से ही extrac में शामिल किया जा सकता हैटेड लिपिड मिश्रण.
  2. डिटर्जेंट solubilized साथ मिश्रण में KvAP की तैयारी 1,2-dioleoyl-3 trimethylammonium-प्रोपेन (DOTAP) या 1,2-dioleoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3 succinate (कुत्तों) --- पूरी लिपिड solubilization का एक उदाहरण पुनर्गठन के लिए
    1. लिपिड तैयारी पोप / POPG पुटिका के रूप में ही है. छोटे unilamellar vesicles में हाइड्रेटेड लिपिड के sonication पोप / POPG लिपिड (आमतौर पर 5-10 मिनट) के लिए की तुलना में अब समय के लिए (आमतौर पर 45-60 मिनट) की जरूरत है. कुत्तों पुटिका धीरे धीरे एक दूसरे के साथ फ्यूज और छोटे तेल बूंदों के रूप में.
      क्योंकि DOTAP और कुत्तों की उच्च गुणवत्ता एसयूवी बाहर बनाने में कठिनाई का reproducibly, हम आम तौर पर पूरी तरह से प्रोटीन के साथ मिश्रण से पहले इन दो लिपिड solubilize.
    2. पूरी तरह से DOTAP या कुत्तों solubilize करने के लिए, sonicated पुटिका डीएम 10 मिमी और 40 मिमी एन octyl-β-डी glucoside (β-ओग) के साथ मिश्रित कर रहे हैं. लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रण (> 15 घंटे) रातोंरात incubated हैकमरे के तापमान पर, और मिश्रण किसी भी छोटे कणों या बूंदों के लिए नहीं होना चाहिए. लेकिन इसके बजाय यह काफी स्पष्ट है. इस चरण में पूरा संतुलन तक पहुँचने की विफलता multilamellar vesicles का एक महत्वपूर्ण अंश के गठन के लिए नेतृत्व करेंगे.
    3. से भी कम या 01:10 के बराबर है कि लिपिड अनुपात: एक प्रोटीन में डिटर्जेंट solubilized DOTAP या कुत्तों के साथ KvAP प्रोटीन मिलाएं. प्रोटीन / डिटर्जेंट / लिपिड मिश्रण अंत से अधिक अंत रोटेशन के साथ 2-3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते की अनुमति दी है.

2.2. Proteoliposomes फार्म करने के लिए डिटर्जेंट का हटाया

  1. डायलिसिस --- अपेक्षाकृत अधिक महत्वपूर्ण मिसेल सांद्रता (सीएमसी ≥ 1.0 मिमी) है कि इस तरह के डीएम और β-ओग के रूप में डिटर्जेंट की धीमी गति को हटाने,,
    प्रत्येक 1.0 मिलीलीटर मिश्रण के लिए 2 लीटर डायलिसिस बफर (तालिका 3) तैयार करें.
    डायलिसिस ट्यूबिंग का एक उपयुक्त लंबाई बाहर कट (MWCO = 10K, 0.70 सेमी चौड़ा), और डि पानी से धो लें. यह जाँच करें और बनाने के लिए महत्वपूर्ण हैट्यूबिंग में कोई दरार नहीं है कि यकीन है. संवेदनशील नमूने लिए, ट्यूबिंग पहले 10 मिमी Tris-एचसीएल pH8.0 और 2.0 मिमी EDTA के एक बफर के साथ इलाज किया जा सकता है, और फिर 3-5 मिनट के लिए उबलते पानी में साफ किया. ट्यूबिंग तो एक सिरे पर clamped और डायलिसिस बफर के साथ rinsed है.
    एक डायलिसिस टयूबिंग में प्रोटीन, लिपिड डिटर्जेंट मिश्रण लोड. समाधान ऊपर छोड़ दिया न्यूनतम अंतरिक्ष साथ ट्यूबिंग के दोनों सिरों दबाना. डायलिसिस बफर में लोड ट्यूबिंग रखो, और टयूबिंग धीरे समाधान में घूमता है तो एक सरगर्मी प्लेट का उपयोग करें. हर 8 घंटे में एक बार डायलिसिस बफर बदलें. प्रोटीन लिपिड डिटर्जेंट मिश्रण पूरी तरह से स्पष्ट किया गया था कि अगर पहले बफर परिवर्तन के बाद, समाधान बादल बन जाना चाहिए. डायलिसिस भी तेजी से होता है, तो ठोस सफेद डायलिसिस टयूबिंग के तल पर precipitates हो सकता है. यह बफर परिवर्तन के समय में, ट्यूबिंग मला, और कई बार उलट होना चाहिए की सिफारिश की है. डायलिसिस बफर के पांच परिवर्तन के बाद, फफोले आमतौर पर तैयार कर रहे हैं.
    हम लिपिड bilayer पर फफोले शूटिंग से डिटर्जेंट के अवशिष्ट राशि की जांच. छोड़ डिटर्जेंट का अभी भी महत्वपूर्ण राशि है, जब बाईलेयर लगभग तुरंत टूट जाता है. यह वर्णमिति विधि का उपयोग कर या पुटिका निलंबन की सतह तनाव को मापने के द्वारा अवशिष्ट डिटर्जेंट मापने के लिए भी संभव है.
  2. कम सीएमसी है कि डिटर्जेंट को हटाने में मदद करने के लिए polystyrene मनकों का उपयोग करें
    कई मामलों में, हम इस तरह के DDM (पानी में सीएमसी ~ 0.17 मिमी) के रूप में कम सीएमसी डिटर्जेंट, का प्रयोग किया है. छोटे हाइड्रोफोबिक pores के साथ मोती इन डिटर्जेंट 14 दूर करने के लिए उपयोग किया जाता है.
    1. मोतियों की तैयारी. 0.5 शुष्क मोतियों की जी और एक 50 मिलीलीटर कोर्निंग ट्यूब में डाल बाहर वजन, 20 मिलीलीटर मेथनॉल जोड़ने के 5 मिनट के लिए 5000 rpm पर मोतियों नीचे स्पिन, फंस बुलबुले को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए एक स्नान sonicator में समाधान sonicate, और तब छानना सबसे मेथनॉल. इथेनॉल और MilliQ पानी से धो दोहराएँ. धोया मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% इथेनॉल में संग्रहीत है, और कर रहे हैंउपयोग करने से पहले एक डिटर्जेंट मुक्त बफर को बदले जाने की जरूरत है.
    2. इलाज किया जा प्रोटीन / लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रण में डिटर्जेंट की राशि का अनुमान है, और डिटर्जेंट निकालने की जरूरत मोतियों की राशि की गणना. DDM और डीएम के लिए बाध्यकारी क्षमता 10 मिलीग्राम डिटर्जेंट के लिए के बारे में 100 मिलीग्राम मोती है. अतिरिक्त पानी के बिना गीला मोतियों से तौला, और प्रोटीन मिश्रण को सीधे जोड़ रहे हैं. कम से कम 15-20 मिनट पूरी तरह प्रभावी होने के लिए मोती के लिए आवश्यक और डिटर्जेंट एकाग्रता की कमी एक स्थिर स्तर 14-16 तक पहुँचता है. ऐसे जैव मोती SM2 रूप ~ 18 मिमी के बराबर 1.0 मिलीलीटर समाधान, polystyrene मोती के 87 मिलीग्राम की कुल में DDM (dodecyl-maltoside) के 8.7 मिलीग्राम निकालने के लिए, पांच बराबर भागों में प्रयोग किया जाता है. कमरे के तापमान पर स्थिर अंत से अधिक अंत रोटेशन के साथ 20-30 मिनट के लिए प्रत्येक अंश के साथ प्रोटीन / लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रण मिलाएं, मोतियों नीचे स्पिन मनकों के अगले अंश स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, और अंत तक दोहराएँ.
      जब डिटर्जेंट concentrसमझना अपने सीएमसी पहुंचता है, हम जानबूझकर समाधान में डिटर्जेंट की छोटी राशि के बड़े लोगों में छोटे फफोले के विलय की सुविधा होगी कि इतने में एक घंटे के लिए उस के लिए समय की अवधि का विस्तार.
    3. अंतिम चरण के बाद डिटर्जेंट की मात्रा का पता लगाने को दूर करने के लिए, 35 मिलीग्राम जैव रेड SM2 मोती जोड़ सकते हैं और 4 घंटे के लिए vesicles के साथ सेते हैं.
      डिटर्जेंट हटाने के लिए प्रक्रियाओं को एक नए प्रोटीन के लिए लागू किया जा रहे हैं ऊपर वर्णित है, यह ~ 1:10 प्रोटीन / लिपिड अनुपात (भार / भार) के साथ शुरू करने के लिए आम तौर पर सलाह दी जाती है. लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रण ध्यान से पर्याप्त डिटर्जेंट पूरी तरह से लिपिड (2A चित्रा) solubilize लिए जोड़ रहे हैं ताकि तैयार रहने की जरूरत है. यह लगातार झटकों (400 आरपीएम) या अंत से अधिक अंत रोटेशन के साथ कमरे के तापमान (1-2 मिमी डीटीटी) के साथ अधिक से अधिक 2 घंटे के लिए लिपिड डिटर्जेंट मिश्रण सेते करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटीन लिपिड के साथ मिलाया जाता है, प्रोटीन / लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रण (रातोंरात प्रोटीन stabl है तो काफी देर तक incubated किया जाना चाहिएई) प्रोटीन युक्त मिसेलस और प्रोटीन से मुक्त मिसेलस बीच डिटर्जेंट और लिपिड का वितरण अपेक्षाकृत भी है तो उस कमरे के तापमान या तो कम या एक ठंडे कमरे में. BioBeads का उपयोग करके डिटर्जेंट के तेजी से हटाने कार्यरत है इसके अलावा, अगर, यह मोतियों की डिटर्जेंट बाध्यकारी क्षमता पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है. डिटर्जेंट की धीमी गति से हटाने की संभावना प्रोटीन उनके अखंडता बनाए रखने और अपेक्षाकृत बड़े आकार का vesicles में डाला बनने के लिए पर्याप्त लिपिड होगा कि यह सुनिश्चित करता है.

2.3. Proteoliposome का संग्रहण और गुणवत्ता नियंत्रण

  1. Vesicles के तैयार हो जाने के बाद तरल नाइट्रोजन में प्रत्यक्ष डूबनेवाला द्वारा aliquots, 50 μl aliquots में उन्हें तैयार करने और फ्लैश फ्रीज. जमे हुए फफोले तो एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमा हो जाती है. फ्रीज पिघलना चक्र कभी कभी हमारे CYS विशेष प्रतिक्रिया में कलाकृतियों को पेश करने के लिए मिला था क्योंकि जैव रासायनिक assays के लिए, हम जमे हुए फफोले का उपयोग नहीं करते. बिजली की रिकॉर्डिंग के लिएहै, हम केवल कम से कम 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस में जमा हो जाती है कि vesicles का उपयोग करें.
  2. एक घनत्व ढाल में vesicles के प्रवर्तन (चित्रा 2B)
    1. 4 में 4 घंटे के लिए 200,000 जी पर 10 मिमी HEPES और स्पिन में की गई 0.3 मिलीलीटर 10, 35 में से प्रत्येक के और 55% सूक्रोज युक्त sucrose के ढाल की परत के ऊपर डिग्री सेल्सियस पर पुटिका निलंबन के 50 μl लोड में तेजी लाने और परतों के बीच इंटरफेस के विघटन से बचने के लिए धीरे धीरे धीमा करना.
    2. ऊपर से नीचे तक 100 μl भिन्न लीजिए और एक गैर कम करने एसडीएस पृष्ठ (चित्रा 2 बी) पर उन्हें चलाने के. KvAP 0.5-1.0 माइक्रोग्राम प्रोटीन का एक बैंड स्पष्ट रूप से दिख रहा है कि इस तरह के Coomassie नीले रंग के साथ अच्छी तरह से दाग है. KvAP प्रोटीन 10 और 35% sucrose के बीच इंटरफेस में पाया जाना चाहिए. प्रोटीन की कोई भारी समुच्चय लगभग सभी प्रोटीन झिल्लियों में हैं यह दर्शाता है कि उच्च घनत्व रेंज में देखा जाता है.
  3. Vesicles में KvAP चैनल के समुचित रचना. <जाँच करेंbr /> हमारी पिछले डेटा ठीक bilayers में एकीकृत जब एक भी सिस्टीन उत्परिवर्ती (L125C/C247S) KvAP,, पूरी तरह से झिल्ली में दफन है, और सिस्टीन विशिष्ट अभिकर्मकों 8 तक पहुँचा नहीं जा सकता है कि स्थापना की. पुनर्गठन प्रक्रियाओं इस उत्परिवर्ती चैनल के साथ परीक्षण किया गया, और एक Cys विशेष अभिकर्मक, एमटीएस-PEG5000 द्वारा जांच की गई. कमरे के तापमान पर 1.0 माइक्रोन टन अभिकर्मक साथ L125C में संशोधन एक nonreducing एसडीएस पृष्ठ जेल में KvAP बैंड के लिए एक 5kDa बदलाव का परिचय. हमारे पुनर्गठन प्रक्रियाओं के सफल कार्यान्वयन bilayers में सभी चैनलों की लगभग पूरी प्रविष्टि, सुझाव फॉस्फोलिपिड झिल्ली में L125C उत्परिवर्ती चैनलों के लिए कोई detectable प्रतिक्रिया का नेतृत्व करना चाहिए. प्रतिक्रिया का एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 5.0 मिमी डीएम टन अभिकर्मक के लिए सुलभ उत्परिवर्ती चैनलों में लगभग सभी L125C अवशेषों रेंडर करने के लिए शुरू की है.
    वैकल्पिक रूप से, इस तरह के chrybdotoxin के रूप में एक रोमकूप बाध्यकारी विष,, tetrameric चैनलों गिनती करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में एक एंटीबॉडी आधारित बंधन(Fv KvAP के लिए एक रचना विशिष्ट ligand के रूप में तैयार किया जाता है जहां बॉक्स 2, देखें) कहते पुनर्गठन vesicles में उपलब्ध साइटों बंधन यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये बाध्यकारी assays तो पुनर्गठन चैनलों के अंश tetramers और प्रोटीन का कितना भाग ठीक से वोल्टेज संवेदक चप्पू (वोल्टेज संवेदक के S3/S4) है क्या कर रहे हैं यह पता लगाने के क्रम में कुल प्रोटीन मापने एक मात्रात्मक परख के साथ तुलना की जा सकती मुड़ा हुआ.
    अन्य प्रोटीन का पुनर्गठन करने के लिए, यह क्या पुनर्गठन प्रोटीन का अंश ठीक से जोड़ रहा है मूल्यांकन करने के लिए एक मात्रात्मक पद्धति शुरू करने की सलाह दी जाती है. सावधान कार्यात्मक परीक्षा इस प्रकार सफल पुनर्गठन के लिए अच्छी गुणवत्ता नियंत्रण के विकास के लिए एक शर्त है.

3. पुनर्गठन चैनल युक्त vesicles के एप्लीकेशन

3.1. कार्यात्मक काला लिपिड झिल्ली में आयन चैनल गतिविधियों का अध्ययन.

N की तैयारीeeded सामग्री.

  1. लिपिड तैयारी
    1. एक गिलास परखनली, Teflon-सामने पेंच टोपी के साथ एक एम्बर शीशी, और क्लोरोफॉर्म के साथ कांच सीरिंज का एक सेट साफ करें. आर्गन गैस की एक धारा के तहत एम्बर शीशी सूखी.
    2. स्थानांतरण 0.75 मिलीग्राम पोप और 0.25 मिलीग्राम एम्बर शीशी में क्लोरोफॉर्म में POPG और आर्गन गैस के साथ क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना.
    3. 0.20 मिलीलीटर पैंटेन, और अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म दूर करने के लिए पूरी तरह से सूखे के साथ सूखे लिपिड धो लें. अंत में 50 μl decane में लिपिड भंग. decane (20 मिलीग्राम / एमएल) में लिपिड एक प्रयोगात्मक बाईलेयर कप (चित्रा 3) के एक पक्ष में पतला भाग में drilled एक 150-250 माइक्रोन छेद (3B चित्रा) के पार एक लिपिड bilayer चित्रकला के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  2. समाधान तैयारी
    1. Intracellular समाधान (पार): 10 मिमी HEPES / KOH, 7.4 पीएच, 15 मिमी KCl
    2. कोशिकी समाधान (सीआईएस): 10 मिमी HEPES / KOH, 7.4 पीएच, 150 मिमी KCl
    3. नमक पुल: बेंड कांच capillariesयू के आकार पुलों में, और कोशिकी समाधान में भंग 1.0% पिघला हुआ अगर साथ उन्हें भरने.
      ट्रांस और सीआईएस समाधान के बीच स्थापित आसमाटिक ढाल लिपिड bilayer 17 पुटिका संलयन के लिए मुख्य प्रेरणा शक्ति हो पाया था. नकारात्मक आरोप लगाया लिपिड के लिए, 15 मिमी 2 CaCl या सकारात्मक आरोप लगाया पाली Arginine पेप्टाइड्स संलयन घटनाओं को उत्पन्न करने में सक्षम होना पाया गया है. ऐसे DOTAP और कुत्तों, आदि के रूप में fusogenic लिपिड, लिपिड में पेश किया जा सकता है संलयन घटनाओं की संभावना अधिक है कि इतनी vesicles.

लिपिड bilayers में KvAP चैनलों से इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डिंग

  1. बाईलेयर कप (3B चित्रा) के बेलनाकार सतह पर drilled है कि गोल छेद (व्यास ~ 0.25 मिमी) पूर्व रंग. लिपिड प्रयोगशाला में किया जाता है कि एक केशिका मूसल से स्थानांतरित कर रहे हैं. केशिका मूसल का दौर सिर पॉलिश है और कप की सतह खरोंच नहीं करता. गुकेशिका मूसल द्वारा किए लिपिड की ई छोटी राशि बाईलेयर कप में छेद के चारों ओर फैला है, और हवा सूखे है.
  2. Decane पूरी तरह से लुप्त हो जाएगा तो यह है कि 1-2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. केयर छेद में हो रहा से लिपिड समाधान से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.
  3. रिकॉर्डिंग कक्ष में कप डालें, और नमक पुलों में डाल दिया है और रिकॉर्डिंग कप के दो पहलू (चित्रा -4 ए) के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट. सीआईएस और छेद के दोनों पक्षों को पार समाधान जोड़ें. एक आसमाटिक ढाल लिपिड bilayer में पुटिका के विलय की सुविधा के लिए स्थापित किया गया है.
  4. ~ 0 (आमतौर पर <2 millivolts) को कप के दो पक्षों के बीच ऑफसेट संभावित समायोजित करें. Decane में लिपिड मिश्रण की एक छोटी राशि के हस्तांतरण, और एक bilayer झिल्ली रूपों तक छेद भर में लिपिड पेंट करने के लिए केशिका मूसल का प्रयोग करें. bilayer के गठन के एक रैंप नाड़ी की प्रसव के दौरान समाई वर्तमान रिकॉर्डिंग से पता चला है.
  5. झिल्ली तक रुकोबाहर thins और अपेक्षाकृत स्थिर हो जाता है. 3-5 मिनट के लिए झिल्ली समाई में अधिक बदलाव नहीं आया है नहीं जब तक हम इंतजार करेंगे.
    , एक बड़ा छेद भर गठन तलीय bilayer के बारे में सामान्य सोच झिल्ली की बहुत मध्य भाग में एक नियमित bilayer के रूप में मोटी ~ 4.0 एनएम होने के करीब है, और यह छेद के किनारे के करीब हो जाता है जब झिल्ली मोटा बनने वहाँ एक वलय के आसपास है और decane विलायक के सबसे अधिक, 19 18 कहाँ है. यह झिल्ली की केंद्रीय बाईलेयर हिस्से में छोड़ा अवशिष्ट decane वहाँ है कि अपरिहार्य है. परमाणु decane बनाम पीसी की मात्रा अनुपात के पिछले अनुमान बाईलेयर 18, 20-22 के पतले होने के बाद 0.35-0.45 था. ईएम पतला बाईलेयर की परीक्षा एक bilayer 22 के दो पत्रक के बीच sandwiched decane के लेंस थे कि पता चला है. इन आंकड़ों लिपिड bilayer झिल्ली में डाला झिल्ली प्रोटीन decane के छोटे द्वीपों (व्यास में ऊपर से 50 एनएम) के साथ एक समय में होना का सुझाव दिया. अवशिष्ट decane मैंएन बाईलेयर भी 0.4-0.5 मापा समाई पर आधारित पतला bilayer के आकार का एक मोटा अनुमान प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो μF / 2 सेमी, करने के लिए निरंतर विद्युत क्षमता कम हो जाती है. 100 पीएफ समाई की एक बाईलेयर व्यास में ~ 180 माइक्रोन के एक परिपत्र बाईलेयर झिल्ली से आता है.
    KvAP लिए, अवशिष्ट decane चैनल समारोह ध्यान से एक विलायक मुक्त bilayer में जांच नहीं की गई है, भले ही इसकी वोल्टेज पर निर्भर gating को ख़राब नहीं था. एक ही NaChBac चैनलों और BLMs 23 में डाला Kv1.2 चैनलों के लिए सच हो दिखाई दिया. यह oocytes में चैनलों को decane-लिपिड bilayer सापेक्ष में Kv1.2 चैनलों से मापा जी.वी. वक्र की महत्वपूर्ण बाएं पारी अवशिष्ट decane 23 के साथ क्या कुछ किया है कि क्या अभी भी स्पष्ट नहीं है. Bilayers बनाने में इस्तेमाल किया लिपिड पर निर्भर करता है, bilayer में अवशिष्ट decane की राशि भिन्न हो सकते हैं. उदाहरण के लिए यह सूचना मिली थी कि तलीय लिपिड membr का गठनMGDG की Anes (मोनो galactosyl-diacylglycerol) decane अणुओं के साथ भरा जा रहा शंक्वाकार MGDG बीच दरारों को संभवतः कारण decane, की आवश्यकता है. अवशिष्ट decane अध्ययन किया जा प्रोटीन पर असर पड़ता है चाहे विशुद्ध अनुभवजन्य है, और प्रयोगात्मक परीक्षण प्रभाव महत्वपूर्ण है या नहीं बताने के लिए की जरूरत है.
  6. जैसे ही झिल्ली स्थिर हो जाता है, के रूप में 0.5-1.0 μl चैनल युक्त सही छेद ऊपर एक p2-पिपेट टिप के ठीक अंत स्थिति से फफोले गोली मार. पुटिका कप की तह तक छेद भर में नीचे गिर जाते हैं.
    इस प्रक्रिया के दौरान, कई vesicles के छेद में झिल्ली को संलग्न हो जाते हैं. पर्याप्त समय को देखते हुए कुछ KvAP चैनलों की एक छोटी संख्या ठीक झिल्ली के मध्य भाग में तलीय बाईलेयर में डाला जाता है ताकि बाईलेयर हिस्से में जुड़े हुए हैं. आसमाटिक ढाल और electrostatic बातचीत दोनों लिपिड bilayers 17, 24 में vesicles के संलयन में महत्वपूर्ण हैं.
  7. परीक्षण करने के लिएBilayer में KvAP चैनलों, 80 एम वी की एक छोटी नाड़ी -80 एम वी की होल्डिंग क्षमता से वितरित किया जाता है. तेजी से निष्क्रियता और निष्क्रियता से धीमी गति से वसूली, एक लंबे अंतराल (पीई / पीजी झिल्ली में चैनलों के लिए ~ 120 सेकंड) के कारण दो दालों के बीच दिया जाता है. एक पोप / POPG झिल्ली में चैनलों से एक ठेठ वर्तमान रिकॉर्डिंग चित्रा -3 सी में पता चला है. मौजूदा छोटा है, अधिक पुटिका गोली मार. वर्तमान आकार में अच्छा लग रहा है एक बार, झिल्ली के दोनों किनारों पर समाधान में आयन सांद्रता संतुलन. चैनल electrophysiological प्रयोगों के लिए तैयार हैं.

3.2. Vesicles में चैनल के खिलाफ रचना विशिष्ट ligands के लिए स्क्रीनिंग

  1. फेज प्रदर्शित पुस्तकालय का परिचय.
    फेज प्रदर्शित 20 पूर्व पेप्टाइड पुस्तकालय filamentous जीवाणुभोजी एफडी-टीईटी 25 के एक छोर पर PIII प्रोटीन की पांच प्रतियां के एन टर्मिनस पर मौजूद है. पुस्तकालय लगभग प्रस्तुत करता है. 1 एक्स 10 8 अलगयादृच्छिक 20 पूर्व पेप्टाइड दृश्यों के ईएनटी प्रकार, और कृपया UT दक्षिण मेडिकल सेंटर 26 में डॉ. Kathlynn ब्राउन की प्रयोगशाला द्वारा हमें प्रदान किया गया था. ई. में फेज संक्रमण कोलाई K91 12 माइक्रोग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन को बैक्टीरिया प्रतिरोधी बनाता है.
    जीवाणु संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया, फगेस और फेज कालोनियों का अनुक्रमण के प्रवर्धन और titering हम अगले भाग में बुनियादी कार्यों का एक संक्षिप्त विवरण दे देंगे McGuire, एट अल. 26 से वर्णित किया गया है. पाठकों McGuire कागज में अधिक जानकारी पा सकते हैं. हम बजाय vesicles में पुनर्गठित आयन चैनल (चित्रा -4 ए) को कसकर बाँध कि विशिष्ट क्लोन के अलगाव पर ध्यान दिया जाएगा.
    हमारे परदे के पीछे मूल विचार यह विशेष रूप से पुनर्गठन चैनलों के लिए बाध्य फगेस vesicles के साथ नीचे खींच लिया जा सकता है. बाध्य फेज लिपिड झिल्ली में चैनलों के खिलाफ प्रवर्धित और परीक्षण किया जा सकता है. के हमारे अध्ययनअलग लिपिड झिल्ली में KvAP वोल्टेज सेंसर के गठनात्मक परिवर्तन 8 यह headgroup क्षेत्रों में फॉस्फेट शामिल नहीं है कि उन लोगों के लिए नियमित रूप से फॉस्फोलिपिड से लिपिड स्विचन द्वारा "सक्रिय" या "आराम" राज्यों में या तो वोल्टेज सेंसर रखने के लिए संभव है कि पता चला (DOTAP और हमारे प्रयोगों में कुत्तों). इन दो लिपिड निर्धारित रचना रचना विशिष्ट ligands के हमारे प्रदर्शन में उपयोग किया जाता है. फेज पुस्तकालय पहली DOTAP और कुत्तों झिल्ली (सकारात्मक चयन) में चैनलों को तंग बाँधने के लिए चयनित किए जाने से पहले फॉस्फोलिपिड vesicles में चैनल (नकारात्मक चयन) से संतृप्त किया जाएगा.
  2. फेज चयन के पीछे मूल प्रक्रियाओं
    लेग माध्यम में K91 बैक्टीरिया की ग्रोथ: बैक्टीरिया की दुगनी होने का समय 37 के बारे में 20 मिनट डिग्री मिलाते 200 आरपीएम के साथ सी है.
    पुस्तकालय के प्रवर्धन: OD0.4 पर बैक्टीरिया K91 के साथ फेज समाधान मिश्रण. 37 पर 15 मिनट ऊष्मायन के बादडिग्री सेल्सियस, मिश्रण 12 ग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन युक्त -9.5 एक्स 9.5 इंच 2 अगर प्लेटों पर समान रूप से फैला रहे हैं, बड़े प्लेटों के उपयोग की उच्च विकास दर है कि बैक्टीरिया की संस्कृति के प्रभुत्व से बचाता है. पुस्तकालय की विविधता छोटा होता है एक बार, 10 सेमी पेट्री डिश चयन और छोटे पैमाने प्रवर्धन के लिए उपयोग किया जाता है.
    व्यक्तिगत क्लोन की बड़े पैमाने पर प्रवर्धन:, 250 मिलीलीटर लेग प्लस 5 मिमी MgSO 4 और 12 माइक्रोग्राम / एमएल टेट्रासाइक्लिन में फगेस (~ 100 करोड़) के एक छोटे से विभाज्य टीका लगाना 37 पर रातोंरात ग्रो डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए 6000 rpm स्पिन से कोशिकाओं को इकट्ठा. तैरनेवाला लीजिए और यह 0.2 / खंड खंड वर्षा बफर (2.5 एम NaCl, 20% PEG8000) में जोड़ें. 1.0 घंटे के लिए बर्फ पर ऊष्मायन के बाद, गोली सब फगेस को 30 मिनट के लिए 17,000 XG पर समाधान अपकेंद्रित्र. 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते 1.0 मिलीलीटर पीबीएस, धीरे गोली (कोई vortexing) resuspend जोड़ने, सभी तैरनेवाला निकालें. एक ताजा ट्यूब को निलंबन स्थानांतरण, और 14,00 पर अपकेंद्रित्र2 मिनट के लिए 0 आरपीएम. एक और ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, और 65 में सेते डिग्री सेल्सियस सभी बैक्टीरिया को मारने के लिए 15 मिनट के लिए पानी स्नान. 13,000 rpm पर 2 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र. गोली, विभाज्य त्यागें और -80 डिग्री सेल्सियस पर फेज समाधान की दुकान
  3. लिपिड vesicles में KvAP चैनलों के खिलाफ फगेस के Panning.
    1. पेप्टाइड प्रदर्शित फगेस परिलक्षित और हमारे प्रयोगों इतना इकाई मात्रा प्रति फगेस की संख्या में जाना जाता है कि पहले titered करने की आवश्यकता है. KvAP नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, और कुत्तों में पोप / POPG (3:1) प्लस 0.50% बायोटिन-डोप vesicles में पुनर्गठन किया गया था: बायोटिन डोप (199:1, उसी DOTAP vesicles के लिए किया गया था) के चयन के लक्ष्य के रूप में प्रयोग किया जाता है. vesicles में KvAP के अंतिम एकाग्रता 0.50 मिलीग्राम / एमएल है, और लिपिड 5.0 मिग्रा / मिली हैं. panning बफर 500 मिमी KCl, 100 मिमी HEPES / KOH के पीएच 7.4, और 0.10 मिलीग्राम / एमएल बीएसए निहित.
      पहली बार चलाने के लिए, ~ 10 10 फगेस (प्रत्येक प्रकार के लिए 100 प्रतियां) 0.050 मिलीग्राम लेग मध्यम को पतला कर रहे थे. बाद में panning कदम, सेंट के लिएarting फेज जून ​​10 - अगस्त 10 के भीतर होने के लिए समायोजित किया गया.
    2. नकारात्मक चयन:
      1.0 मिलीलीटर panning बफर में, 100 μl NeutrAvidin agarose मोती (पियर्स राल का मिलीलीटर प्रति बाध्यकारी 1-2 मिग्रा biotinylated बीएसए करने में सक्षम) के साथ 50 μl लेग में पतला फगेस सेते हैं. 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, 1.0 मिनट के लिए 100 XG पर उन्हें कताई द्वारा मोती अलग. दो बार मोती को सीधे बाँध कि किसी भी फगेस दूर करने के लिए इस चरण को दोहराएँ.
      कोई प्रोटीन होते हैं कि 50 μl खाली vesicles के साथ पिछले चरण (पोप / POPG अधिक 0.5% बायोटिन डोप) से पर छोड़ दिया फगेस मिलाएं. फेज-पुटिका मिश्रण करने के लिए panning बफर के साथ धोया गया है कि 100 μl NeutrAvidin मोती जोड़ें. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण घुमाने के बाद, 30 सेकंड के लिए 100 XG स्पिन से मोती निकालने के. बायोटिन डोप (199:1) और साथ ही पोप / POPG vesicles में KvAP चैनल (0.5% बायोटिन डोप के साथ) के लिए: यह कदम कुत्तों की खाली vesicles के लिए दोहराया है. इन उपचार contai के बाद सतह पर तैरनेवालाएनएस फगेस पूरी तरह से मंजूरी दे दी. पहले दो स्क्रीन चक्र के बाद, preclearance पोप / POPG vesicles में KvAP के खिलाफ ही किया जा सकता है.
    3. सकारात्मक चयन
      10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 100 μl NeutrAvidin मोतियों की उपस्थिति में बायोटिन डोप (199:1) पुटिकाओं (DOTAP vesicles के लिए एक ही): कुत्तों में KvAP चैनलों के साथ पूरी तरह से मंजूरी दे दी फगेस सेते हैं. 10 मिनट के लिए 100 XG पर centrifugation पहले panning बफर का उपयोग कर 15 मिलीलीटर मिश्रण की मात्रा लाओ. मोती लीजिए, और 45 मिलीलीटर panning बफर के साथ उन्हें तीन बार धो लो.
    4. 5.0 माइक्रोग्राम / एमएल बायोटिन युक्त 500 μl लेग माध्यम में मोती Resuspend, और देशी बायोटिन की तुलना में कम समानता है जो NeutrAvidin, से बाध्य फगेस में से कुछ को रिहा करने के क्रम में दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते हैं. एक मिनट के लिए 100 XG स्पिन द्वारा मोती अलग करें. Titering के लिए दो अलग अलग ट्यूबों में सतह पर तैरनेवाला और मोती लीजिए.
    5. चयनित फगेस, मीटर बढ़ाना500 μl K91 जीवाणु संस्कृति के साथ अंतिम चरण (OD600 ~ 0.4-0.6, सुसंस्कृत ~ यह प्रयोग किया जाता है 4 घंटे पहले) में सतह पर तैरनेवाला या resuspended मोती के नौ 200 μl. 37 पर ऊष्मायन के बाद डिग्री सेल्सियस रातोंरात संस्कृति के लिए टेट्रासाइक्लिन प्लेटों पर प्रत्येक के 15 मिनट, थाली 50 μl के लिए.
      सभी फेज कालोनियों की वसूली और बढ़ाना करने के क्रम में पहले दो स्क्रीन चक्र के दौरान (चित्रा -4 ए), अंतिम चरण से सभी 500 μl तैरनेवाला और मोती एकत्र 5 मिलीलीटर बैक्टीरिया संस्कृति के साथ उन्हें मिश्रण, और 9.5 इंच वर्ग प्लेटों में प्लेट उन्हें . यह कदम बैक्टीरिया दूसरों की तुलना में धीमी हो जाना कि उन फगेस उबरने के लिए महत्वपूर्ण है.
    6. प्लेटों से कालोनियों (McGuire, एट अल., 26 देखें) panning और चयन के अगले चक्र से पहले प्रवर्धित और titered कर रहे हैं.
    7. चैनलों पर सकारात्मक चयनित फगेस की गतिविधियों की जांच करना.
      चयन के 10-12 चक्र के बाद, लिपिड BILA में KvAP चैनलों पर कुल परिलक्षित फगेस परीक्षणyers पोप / POPG का बना दिया. सकारात्मक क्लोन का एक महत्वपूर्ण अंश नहीं हैं, तो हम आराम की स्थिति में स्थिर चैनलों के खिलाफ चयन किया गया, के रूप में 100-500 एनएम पर चयनित फगेस (चित्रा 4 बी) bilayer में चैनलों का एक महत्वपूर्ण अंश ब्लॉक करना चाहिए. सकारात्मक डेटा आराम की स्थिति में चैनल के बंधन को मजबूत दिखा देंगे कि क्लोन सुझाव है कि वहाँ. चयन के 16 चक्रों के बाद एकल कॉलोनी अनुक्रमण के लिए 50 सकारात्मक कालोनियों लेने. पहचान हावी फेज क्लोन दृश्यों की तुलना से चयन कर रहे हैं, और प्रवर्धित और bilayers में चैनल के खिलाफ जांच की जाती है. सकारात्मक क्लोन की पुष्टि हो जाने के बाद, मजबूत सकारात्मक क्लोन द्वारा किए पेप्टाइड्स synthesize और उनकी रचना विशिष्ट गतिविधियों की पुष्टि करने के साथ ही चैनलों पर परीक्षण.

3.3. संरचना निर्धारण 27-29 के लिए झिल्ली में KvAP चैनलों के क्रिस्टलीकरण

  1. की रचना को स्थिर करने के लिएचैनल, चैनल, 33H1 Fv प्रोटीन की एक रचना विशेष बांधने की मशीन, KvAP / Fv जटिल फार्म का उपयोग किया जाता है. Fv प्रोटीन की तैयारी बॉक्स 2 में विस्तृत है. एक Superdex 200 स्तंभ में जटिल शुद्ध. हमारी प्रणाली में 11.4 आसपास मिलीलीटर में जटिल elutes.
  2. प्रारंभिक स्क्रीन के लिए, पूरी तरह से डीएम या β-ओग में solubilized है कि DMPC या POPC साथ प्रोटीन मिश्रण. प्रोटीन / लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रण मिश्रित मिसेलस बीच तीन घटकों के वितरण में एक thermodynamic संतुलन तक पहुँचने के क्रम में 15 से अधिक घंटे के लिए मिलाया जाता है. आमतौर पर हम पहले तीन अलग लिपिड / प्रोटीन अनुपात (LPR = 0.5, 1.5, 2.5) और तीन अलग पीएच स्तर (6.0, 7.0, और 8.0) का परीक्षण. डायलिसिस बफर 20 मिमी कश्मीर फॉस्फेट बफर, 100 मिमी KCl, और 3.0 मिमी NaN3 होता है. डायलिसिस बफर 2-3 दिनों हर बदल रहा है. क्रिस्टल के एक छोटे से विभाज्य vesicles के गठन और क्रिस्टलीय जाली के संभावित उपस्थिति की जांच करने के लिए हर 2-3 दिन बाहर ले जाया जाता है.
    एक अखबार सूचीLPR के बनाम पीएच लिपिड के दो विभिन्न प्रकार के प्रोटीन के व्यवहार को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम डायलिसिस नमूने नकारात्मक दाग EM द्वारा जांच कर रहे हैं जब (अधिक से अधिक 150 एनएम) के अपेक्षाकृत बड़े आकार vesicles या झिल्ली चादरें प्राप्त करना चाहते हैं. झिल्ली में एक छोटे से नियमित पैटर्न एक हिट चलता है और आगे अनुकूलन मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    नकारात्मक दाग ईएम: कार्बन फिल्मों (~ 3-5 मोटी एनएम) के साथ लेपित कॉपर ग्रिड कर रहे हैं चमक छुट्टी दे दी कार्बन सतह हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए हवा में. क्रिस्टल निलंबन की एक छोटी मात्रा (2-3 microliters) कार्बन सतह पर भरा हुआ है, और 0.5-1.0 मिनट के लिए incubated है. वाटमान # 4 फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के एक फटे बढ़त के साथ कंधे से ग्रिड दाग. ग्रिड पलटें और 150 माइक्रोलीटर धुंधला समाधान (2.0% की एक बूंद के शीर्ष पर ~ 15 सेकंड के लिए यह सेते पीटीए / KOH के पानी में पीएच 8.0 से अधिक 0.5% trehalose, या 6.0% अमोनियम molybdate / KOH, pH6.3-6.5 पानी में अधिक 0.5-1.0% trehalose). जितना संभव टी से समाधान ब्लाटवह ग्रिड सतह, और ग्रिड परीक्षा के लिए एक मंदिर में डालने से पहले सूखे की अनुमति. Vesicles की छवियाँ इलेक्ट्रॉनों द्वारा किसी भी क्रिस्टलीय पैकिंग के नुकसान से बचने के लिए कम खुराक शर्त के तहत रखा जाता है.
  3. स्क्रीन तो एक सही LPR तक पहुंचने के लिए LPR के छोटे कदमों की जांच करने के लिए विस्तार किया गया है. प्रोटीन crystallization के लिए उपयुक्त हैं, झिल्ली में प्रोटीन की एक छोटी जाली दृष्टिगोचर हो सकता है. इन प्रारंभिक स्थितियों के आसपास, आगे नमक प्रकार और सांद्रता, तापमान, गति और डिटर्जेंट हटाने, द्विसंयोजक फैटायनों, प्रोटीन तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया डिटर्जेंट, precipitants, लिपिड संरचना आदि के तरीकों अलग से क्रिस्टलीकरण अनुकूलन
    KvAPΔ36/Fv परिसर के अनुकूलित 2 डी क्रिस्टल 20-30 माइक्रोन (चित्रा 5A) के लिए कुछ माइक्रोन से बड़ी चादर है कि सीमा में हो जाना. चार गुना सममित चान से उम्मीद के रूप में cryoEM शर्तों के तहत, क्रिस्टल स्पष्ट चार गुना समरूपता के साथ स्पष्ट वर्ग जाली दिखानेnels (चित्रा 5B और सी).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

जैव रासायनिक एकरूपता में KvAP चैनल सफ़ाई के लिए प्रयोगों का सामान्य प्रवाह चित्रा 1 ए में वर्णित है. प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शोधन के दौरान विशिष्ट नमूने चित्रा 1 बी में एसडीएस पृष्ठ जेल में पता चला है. IMAC शुद्धि के बाद प्रोटीन अपेक्षाकृत शुद्ध है. KvAP चैनल की उपज 1.0 के बारे में मिलीग्राम / लीटर संस्कृति है.

डिटर्जेंट के साथ लिपिड vesicles के solubilization लिपिड बनाम डिटर्जेंट की प्रत्येक जोड़ी के लिए बाहर काम करने की आवश्यकता है. डीएम ने पोप / पोप के छोटे unilamellar vesicles के solubilization 2A चित्रा में प्रस्तुत किया है, vesicles के प्रवर्तन से परिणाम आम तौर पर काफी सरल हैं. ढ़ाल से अंशों की एसडीएस पृष्ठ परख में ठेठ परिणाम चित्रा 2B में दिखाया जाता है. Sucrose के घनत्व ढाल में, चैनल युक्त पोप / POPG फफोले आमतौर पर 10% परत एक के बीच इंटरफेस पर केंद्रित कर रहे हैंघ 35% परत. KvAP युक्त DOTAP या कुत्तों पुटिका घट गया है और आमतौर पर इंटरफेस के बीच 5% और 10% (थोड़ा 10% परत में प्रवेश कर रहे हैं). Multilamellar vesicles का एक महत्वपूर्ण अंश हैं, तो वे आमतौर पर 10-35% इंटरफ़ेस नीचे सफेद और केंद्रित कर रहे हैं. हम यह आमतौर पर प्रोटीन डिटर्जेंट लिपिड मिश्रण काफी देर तक लिपिड का अच्छा वितरण तक पहुँचने के लिए incubated नहीं किया गया था, जब ऐसा होता है कि पाया.

तलीय लिपिड bilayers में शामिल KvAP चैनलों से इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डिंग 3 चित्र में दिखाया जाता है. ठेठ वर्तमान ट्रेस -80 एम वी पर, चैनलों को शांत कर रहे हैं कि पता चलता है. 80 एम वी स्विचिंग एक त्वरित समाई शिखर (वोल्टेज स्विचिंग के समय में तेजी से एक) की ओर जाता है. वर्तमान की एक धीमी गति से बढ़ चरण चैनलों सक्रिय हो जाते हैं और जावक पोटेशियम वर्तमान संचालन करने में सक्षम होते हैं. बढ़ती चरण के शिखर के बाद, वर्तमान, निष्क्रियता नामक एक कदम कम करने के लिए शुरू होता है. inactivatiपर पूरा करने के लिए कुछ सौ मिलीसेकेंड लेता है. वोल्टेज -80 एम वी के लिए वापस बंद हो जाने के बाद, खुला चैनल के बंद को दर्शाता है और क्रियाशीलता छोड़ना (चित्रा -3 सी) कहा जाता है, जो नीचे समाई चोटी के बाद एक लौट चरण में है.

फेज स्क्रीन के बीच में, हम पोप / POPG की bilayers में KvAP चैनलों पर परिलक्षित फगेस की गतिविधि का परीक्षण किया. 12 चयन चक्र के बाद, प्रवर्धित फगेस चैनल गतिविधियों (चित्रा 4 बी, चयनित फेज) हिचकते. लेकिन शुरू फेज-प्रदर्शित पुस्तकालय चैनल (चित्रा 4 बी, नियंत्रण फेज) पर कोई असर नहीं दिखा था. सकारात्मक फगेस से केवल एक कम एकाग्रता के आसपास थे क्योंकि चयनित फगेस की गतिविधियों को बहुत अधिक नहीं थे, हालांकि, स्पष्ट, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रभाव उच्च बंधन आत्मीयता दिखा रहे हैं कि सक्रिय, सकारात्मक क्लोन है कि वहाँ का सुझाव दिया, चुनिंदा दौरान समृद्ध किया जाना चाहिए शेष स्क्रीनिंग cycles और एक बार समृद्ध, झिल्ली में चैनलों पर मजबूत निरोधात्मक गतिविधियों है की संभावना है.

2 डी क्रिस्टल स्क्रीनिंग के प्रारंभिक चरण में, हम कई छोटे फफोले में छोटे lattices के देखा. अनुकूलन के साथ, कुछ बड़ी चादर के आसपास छोटे फफोले (चित्रा 5A) का एक बहुत कुछ के साथ आए थे. इन क्रिस्टलों के cryoEM छवियों हमेशा आगे अनुकूलन बेहतर क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, सुझाव है कि स्थानीय दोष (चित्रा 5 ब) का एक बहुत से पता चला है. क्रिस्टल अच्छी तरह से अनुकूलित कर रहे थे एक बार, वे तेज किनारों प्रदर्शन किया, और एक पत्र के रूप में दिखाई दिया. उच्च बढ़ाई, व्यक्तिगत इकाइयों स्पष्ट रूप से बहुत बेहतर है (चित्रा 5C) के आदेश दिए हैं.

अभिकर्मक / सामग्री के नाम कंपनी कुल संख्या टिप्पणियां
Tryptone आरपीआई कार्पोरेशन T60060
खमीर निकालें आरपीआई कार्पोरेशन Y20020
NaCl मछुआ S271-3
Tris बेस आरपीआई कार्पोरेशन T60040
पोटेशियम क्लोराइड मछुआ BP366-500
परमाणु Dodecyl-β-डी Maltoside Affymetrix D322S सोल ग्रेड
परमाणु Octyl-β-डी glucoside Affymetrix O311 एना ग्रेड
Aprotinin आरपीआई कार्पोरेशन A20550-0.05
Leupeptin आरपीआई कार्पोरेशन L22035-0.025
Pepstatin एक आरपीआई कार्पोरेशन P30100-0.025
PMSF P7626
DNase मैं रॉश 13407000
जैव मनका एस.एम.-2 जैव रेड 152-3920
HEPES आरपीआई कार्पोरेशन H75030
पोप अवंती ध्रुवीय Lipids 850757C
POPG अवंती ध्रुवीय Lipids 840457C
कुत्तों अवंती ध्रुवीय Lipids 870314C
DMPC अवंती ध्रुवीय Lipids 850345C
बायोटिन डोप अवंती ध्रुवीय Lipids 870282C
DOTAP अवंती ध्रुवीय Lipids 890890C
NeutrAvidin आगागुलाब मोती Piercenet 29200
डायलिसिस ट्यूबिंग स्पेक्ट्रम प्रयोगशालाओं, इंक 132-570
पैंटेन मछुआ R399-1
Decane टीसीआई अमेरिका D0011
टन-PEG5000 टोरंटो अनुसंधान रसायन M266501

तालिका 1. अभिकर्मकों और सामग्री की सूची.

  • इनक्यूबेटर मिलाते बैक्टीरियल संस्कृति
  • स्पेक्ट्रोफोटोमीटर
  • माइक्रो जांच sonicator
  • घुमाव
  • बैक्टीरिया संस्कृति इकट्ठा करने के लिए और ध्यान केंद्रित कर नमूने लिए मंजिल मॉडल अपकेंद्रित्र
  • खाली कॉलम
  • Superdex 200 स्तंभ एक FPLC प्रणाली से जुड़े

तालिका 2. उपकरण की जरूरत है.

बफर नाम अंतर्वस्तु
IMAC lysis बफर 50 मिमी Tris (8.0 पीएच), 100 मिमी KCl
IMAC धो बफर 50 मिमी Tris (8.0 पीएच), 100 मिमी KCl, और 5.0 मिमी डीएम
IMAC क्षालन बफर 50 मिमी Tris (8.0 पीएच), 100 मिमी KCl, 5.0 मिमी डीएम, और 300 मिमी imidazole
एसडीएस नमूना बफर (5X) (nonreducing) 60 मिमी Tris-एचसीएल (6.8 पीएच), 25% ग्लिसरॉल, 2.0% एसडीएस, 0.10% bromophenol नीला. (1.0% 2-mercaptoethanol कम करने बफर बनाने के लिए जोड़ा).
एसडीएस पृष्ठ (4X) के लिए जेल बफर Stacking 0.50 एम Tris-एचसीएल (6.8 पीएच), 0.40% एसडीएस
एसडीएस पृष्ठ (4X) के लिए संकल्प जेल बफर 1.5 एम Tris-एचसीएल (पीएच 8.8), 0.40% एसडीएस
FPLC equilibराशन 20 मिमी Tris 8.0 पीएच, 100 मिमी KCl, और 5.0 मिमी डीएम
Liposome डायलिसिस 10 मिमी HEPES, 100 मिमी KCl

तालिका 3. बफर नाम और सामग्री.

चित्रा 1
चित्रा 1. पुनर्गठन के लिए KvAP की तैयारी. प्रोटीन अभिव्यक्ति, शोधन और पुनर्गठन की. जनरल काम प्रवाह. प्रोटीन की बी बायोकेमिकल शुद्धि. ई. से प्रेरित संस्कृति कोली XL1 नीले व्यक्त KvAP संसाधित और KvAP शुद्ध किया गया था. सेल संस्कृतियों के बीस microliters के पहले (लेन 1) के बाद या (2 लेन) प्रेरण, डिटर्जेंट निकालने (3 लेन), IMAC क्रोमैटोग्राफी से प्रवाह के माध्यम से (4 लेन), दो वाशिंग कदम (गलियों 5.6), और कुल का 5.0 माइक्रोग्राम बाद प्रोटीन300 मिमी imidazole क्षालन (लेन 7) और आकार अपवर्जन FPLC की KvAP टेट्रामर बाहर (8 लेन) के 5.0 ग्राम 12% एसडीएस पृष्ठ और Coomassie नीले धुंधला गैर को कम करने के लिए किए गए थे.

चित्रा 2
चित्रा 2. पोप / POPG vesicles में KvAP का पुनर्गठन. डिटर्जेंट सांद्रता के एक समारोह के रूप में ए. पुटिका संलयन और solubilization. 410 एनएम पर absorbance पुटिकाओं (आधारभूत कोई डिटर्जेंट अंश को घटाया) के प्रकाश बिखरने की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया था. लिपिड (पोप / POPG 3:1) 10 मिलीग्राम / एमएल थे. मजबूत sonication के बाद छोटे unilamellar पुटिका, monodispersed और व्यास में 30-50 एनएम के अपने आकार की वजह से कमजोर बिखरने है. डिटर्जेंट पेश किए गए, वे समाधान चरण और लिपिड झिल्ली चरण के बीच वितरित की. छोटे में मजबूत वक्रता की वजह unilamellar पुटिका, पेश डिटर्जेंट ट्रिगर पुटिका संलयन और वक्रता की रिहाई (इस प्रकार कम सतह संभावित ऊर्जा). इनकार vesicles के आकार में बड़े होते हैं और 410 एनएम पर मजबूत बिखरने दिखा. चोटी के बढ़ते चरण (ग्रे रंग का क्षेत्र) इसलिए डिटर्जेंट प्रेरित संलयन, vesicles के लिए प्रोटीन मिसेल संलयन के लिए एक अच्छा शासन को दर्शाता है. सही अवशोषण चरम पर डिटर्जेंट (यहाँ एक उदाहरण के रूप में डीएम) की एकाग्रता वास्तव में हमारे पुनर्गठन प्रक्रिया के लिए चुना गया था. बी पुनर्गठन KvAP vesicles के पचास microliters (KvAP 0.5 मिलीग्राम / एमएल) sucrose के घनत्व ढाल से अलग हो गया था. सुक्रोज ढाल के नीचे से ऊपर (1 ~ 9) से 100 μl अंशों के नमूने एसडीएस पृष्ठ को कम करने के लिए एक 12% में assayed थे. जेल Coomassie नीले सना हुआ था. 3 लेन ~ 2 ग्राम KvAP निहित.

/ Files/ftp_upload/50436/50436fig3.jpg "/>
चित्रा 3. पुनर्गठन bilayers में KvAP चैनल की इलेक्ट्रिकल गतिविधि. सेट अप एक फैराडे पिंजरे, 1 अंदर रिकॉर्डिंग, दो इलेक्ट्रोड, 2, ट्रांस ओर, 3, सीआईएस ओर, 4;. नमक पुल बी एक छेद 5 दिखा बाईलेयर कप के एक पक्ष में पतला हिस्से की धारा बढ़ाया , झिल्ली बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. काले लिपिड झिल्ली में जुड़े हुए थे कि KvAP चैनलों की सी. इलेक्ट्रिकल गतिविधि दर्ज की गई थी. -80 एम वी पर आयोजित किया जा रहा है, जबकि झिल्ली क्षमता 150 मिसे के लिए 80 एम वी स्पंदित, और उसके बाद होल्डिंग क्षमता को वापस कर दिया गया. ईओण का वर्तमान एक Axopatch 200B एम्पलीफायर का उपयोग वोल्टेज दबाना मोड में दर्ज की गई थी.

चित्रा 4
4 चित्रा. Conformati लिए स्क्रीनिंगएक फेज-प्रदर्शित पुस्तकालय से पर विशिष्ट ligands. आयन चैनल के खिलाफ स्क्रीनिंग के पीछे एक. योजना में vesicles का पुनर्गठन. पुटिका बायोटिन डोप के साथ डाल दिया गया है, और वे NeutrAvidin मोतियों से समाधान से बाहर निकाला जा सकता है. KvAP चैनल की रचना विशिष्ट लिपिड द्वारा नियंत्रित किया जाता है. फगेस लक्ष्य गठनात्मक राज्य में चैनलों (यहाँ एक उदाहरण के रूप में DOTAP या कुत्तों में) के साथ incubated हैं पहले मोती, खाली vesicles और एक अलग रचना में चैनलों के साथ vesicles के खिलाफ नकारात्मक सेलेक्शन हो चुकी हैं. चयनित फगेस bilayers में चैनल के खिलाफ प्रवर्धित और परीक्षण किया जा सकता है. स्क्रीन के बीच में चयनित फगेस के बी परीक्षण. शुरू फेज पुस्तकालय (कुल:., पीले रंग का पता लगाने के - बाद - 2 मिनट, लाल ट्रेस इसके बाद 10 मिनट के शीर्ष अलावा पहले - काले ट्रेस: ​​चयनित फगेस के अलावा के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर bilayer में KvAP की इलेक्ट्रिकल गतिविधि ~ 10 10 फगेस जोड़ादोहरी परत के लिए) bilayer में चैनलों पर परीक्षण किया गया था, और प्रत्येक फेज क्लोन के बारे में केवल 100 प्रतियां नीचे है क्योंकि कोई detectable गतिविधि है पाया गया था. 12 चयन चक्र के बाद, फगेस अभी भी विभिन्न क्लोन का एक मिश्रण थे. , चैनल गतिविधि का स्पष्ट निषेध करने bilayer के नेतृत्व में चैनल को 10 के बारे में 10 फगेस जोड़ना उच्च संबंध होना चाहिए कि सकारात्मक क्लोन कर रहे हैं कि सुझाव. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. झिल्ली में KvAP के दो आयामी क्रिस्टलीकरण. क्रिस्टल अनुकूलन के बीच में नकारात्मक दाग एक परत 2 डी क्रिस्टल के छवि. क्रिस्टल 6.0% अमोनियम साथ दाग रहे थेmolybdate, पीएच 6.4 से अधिक 0.50% trehalose. चीनी के कारण, वे कभी कभी एक दूसरे के साथ ढेर. काला चौकोर बॉक्स ~ 20 एक के लिए जा रहा विवर्तन धब्बों के साथ सही पक्ष पर दिखाया विवर्तन पैटर्न को जन्म देता है कि एक क्षेत्र designates. (ए) में इस्तेमाल एक के समान एक नमूना से एक 2 डी क्रिस्टल के बी CryoEM छवि. नमूना 3% trehalose के साथ मिलाया जाता है और प्रत्यक्ष डूबनेवाला से जमे हुए, और एक cryoEM तहत उतारी थी. छवि 50,000 एक्स में प्राप्त हुई थी. यह क्रिस्टल पैकिंग में स्थानीय दोष थे कि स्पष्ट था. एक आगे अनुकूलित क्रिस्टल की सी. CryoEM छवि. नमूना 0.75% टनीन और 10% trehalose में एम्बेडेड था और छवि 50,000 एक्स में सीधे लाइनों और तंग पैकिंग चैनलों अच्छी तरह क्रिस्टल के इस प्रकार के आदेश दिए थे कि सुझाव लिया गया था. दो काला तीर वर्ग जाली निशान.

बॉक्स:

बॉक्स 1. IMAC स्तंभ की तैयारी

  1. अच्छी तरह IMAC राल Resuspend.
  2. इसके तत्काल बाद एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को निलंबन में राल के लिए आवश्यक राशि हस्तांतरण. हम 2 एल संस्कृति से KvAP की शुद्धि के लिए राल के 2 मिलीलीटर बिस्तर मात्रा का उपयोग करें.
  3. राल नीचे गोली को दो मिनट के लिए 700 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र.
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागें.
  5. MQH 2 हे के 10 बिस्तर मात्रा में जोड़ें और राल कुल्ला करने के लिए संक्षेप में मिश्रण.
  6. राल नीचे गोली से 2 मिनट के लिए 700 XG पर Recentrifuge. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  7. MQH 2 हे के 10 बिस्तर मात्रा में जोड़ें और खाली कॉलम में डाल देना.
  8. राल बैठ जाती हैं जब तक प्रतीक्षा करें, और कम दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए एक प्रवाह एडाप्टर के साथ कॉलम बंद हुआ.
  9. स्तंभ के माध्यम से MQH 2 हे और संतुलन बफर के 5 बिस्तर संस्करणों के 5 बिस्तर संस्करणों चलाएँ.

बॉक्स 2. Fv का शोधन

Fv परिवर्तन - दिवस 1

  1. परिवर्तन100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन, और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते युक्त चार लेग अगर प्लेटों पर FV-उनका JM83 सक्षम कोशिकाओं की 6-60 μl, प्लेट बैक्टीरिया युक्त प्लाज्मिड के 100 एनजी.
  2. जीवाणु संस्कृति के लिए 6 एक्स 1 एल लेग तैयार.

Fv की अभिव्यक्ति - दिवस 2

  1. लेग माध्यम में प्लेटों से सभी कालोनियों स्क्रैप. एम्पीसिलीन (100 मिलीग्राम / एल) की उपस्थिति में 6 एक्स 1 एल लेग बैक्टीरिया की इस निलंबन जोड़ें और OD600 0.5 तक पहुँच जाता है जब तक सेते हैं.
  2. आयुध डिपो 0.5 तक पहुँच जाता है, 115-20 डिग्री सेल्सियस और RPM को तापमान में कमी. जब ~ 20 को तापमान ड्रॉप डिग्री सेल्सियस, 20 में प्रोटीन अभिव्यक्ति और सेते एक और 5 घंटे के शामिल होने की शुरुआत करने के लिए जोड़ anhydrotetracycline (DMF में 1mg/ml के 100 μl 1 एल) डिग्री सेल्सियस सामान्य झटकों के साथ.
  3. हार्वेस्ट 15 मिनट के लिए 4000 XG पर 1 एल अपकेंद्रित्र बोतल में बैक्टीरिया. जितना संभव तैरनेवाला बाहर डालो. में बर्फ पर काटा बैक्टीरिया रखेंरात में एक 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे.

दिन 3 - बैक्टीरिया से Fv अणुओं का विमोचन

  1. Fv को रिहा बफर के 150 मिलीलीटर (50 मिमी Tris पीएच 8.0, 20% सूक्रोज, 1.0 मिमी EDTA) में बैक्टीरिया Resuspend.
  2. एक चुंबकीय सरगर्मी पट्टी के साथ सरगर्मी जबकि, 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर लाइसोजाइम जोड़ने के लिए और 30 मिनट के लिए बर्फ पर बैक्टीरिया रहते हैं. बाद में, 2.0 मिमी तक 2 MgCl जोड़ सकते हैं और एक और 10-15 मिनट के लिए बर्फ पर रहते हैं.
  3. 4 में 30 मिनट के लिए 20,000 XG पर इलाज बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस बैक्टीरियल spheroblasts सभी गोली करने के लिए नीचे जाना चाहिए, और Fv अणुओं की सबसे तैरनेवाला में जारी कर रहे हैं.
  4. कम से कम 4 घंटे के लिए ठंडे कमरे में धोने बफर के 4.0 एल (20 मिमी Tris 8.0 पीएच, 100 मिमी NaCl) के खिलाफ तैरनेवाला Dialyze. दिन के अंत में, ताजा डायलिसिस बफर बदलने के लिए और रातोंरात dialyze. समाधान में सुक्रोज के कारण, डाइलासेट की मात्रा के बारे में 50% की वृद्धि होगी. डायलिसिस टयूबिंग से अधिक प्रयोग किया जाना चाहिए.

IMAC शुद्धि और FPLC - 4 दिवस

  1. 50 मिलीलीटर ट्यूब में डायलिसिस बफर के साथ IMAC शुद्धि राल (बॉक्स 1 देखें) का 10 मिलीलीटर बिस्तर मात्रा संतुलित करना.
  2. 10 मिमी के लिए 2 MgCl जोड़ने और 200 मिलीलीटर की मात्रा में वृद्धि, ट्यूबिंग से डाइलासेट स्थानांतरण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पूर्व equilibrated राल और सेते साथ मिक्स
  3. Incubated राल के साथ खाली कॉलम पैक, और 10 मिमी imidazole और 30 मिमी imidazole प्रत्येक के साथ बफर धोने के 5 बिस्तर संस्करणों द्वारा पीछा धोने बफर के 5 बिस्तर संस्करणों, साथ राल धोने.
  4. धोने बफर के 20 मिलीलीटर से अधिक imidazole 300 मिमी के साथ बाध्य प्रोटीन Elute.
  5. बफर धोने के साथ पूर्व equilibrated Superdex 200 स्तंभ के माध्यम से केंद्रित Fv चलाएँ. पूल एक साथ Fv (ठेठ चोटियों 17.6 मिलीलीटर प्रतिधारण मात्रा पर पता चलता है) युक्त भिन्न और यह ध्यान देना. 280 एनएम पर Fv के विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग कर नमूने की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अलग झिल्ली में KvAP चैनलों के पुनर्गठन के कई अध्ययनों से 8-10 में इस्तेमाल किया गया है. डिटर्जेंट / लिपिड मिश्रित मिसेलस और प्रोटीन / डिटर्जेंट / लिपिड मिश्रित मिसेलस बीच लिपिड का वितरण सुनिश्चित करने के विचार के बाद, हम बहुत अलग लिपिड के बने झिल्ली में KvAP का लगभग पूरा पुनर्गठन तक पहुँचने में सक्षम हैं. प्रत्येक tetrameric KvAP चैनल पूरी तरह से अपने transmembrane डोमेन कवर करने के लिए ~ 100 लिपिड अणु की जरूरत है. अनिवार्य आवश्यकता डिटर्जेंट निकाले जाने से पहले पर्याप्त लिपिड अणु प्रोटीन / लिपिड / डिटर्जेंट मिसेलस में फ्यूज करने की अनुमति है. हमारे मानक स्थितियों (0.5 मिलीग्राम प्रोटीन और 5.0 मिलीग्राम लिपिड) औसत पर कर रहे हैं कि ~ प्रोटीन अणु प्रति 1,000 लिपिड अणु सुनिश्चित करते हैं. हमारी प्रवर्तन प्रयोग और जैव रासायनिक प्रयोगों पुनर्गठन लगभग पूरा हो गया है कि पुष्टि की. काला लिपिड झिल्ली में डाला चैनलों से इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डिंग, पुनर्गठन चैनलों की स्क्रीनिंग एकgainst एक फेज प्रदर्शित पेप्टाइड पुस्तकालय, और झिल्ली में चैनलों की 2 डी क्रिस्टल के विकास के सभी विभिन्न प्रयोजनों के लिए झिल्ली पुनर्गठन के सफल आवेदन का प्रदर्शन.

एक फेज प्रदर्शित पेप्टाइड पुस्तकालय के खिलाफ KvAP चैनलों और स्क्रीनिंग के लिपिड निर्भर गठनात्मक परिवर्तन के बजाय विशिष्ट रचना 8 में चैनलों रखने के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पर भरोसा कर के जैव रासायनिक विधियों द्वारा चैनल ब्लॉकर्स या चैनल के सलामी बल्लेबाजों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक नया अवसर प्रदर्शन. रचना विशेष बाँधने के लिए हमारे स्क्रीन में सफलता उसी रणनीति सक्रिय रचना के लिए विशिष्ट बाँधने खोजने के लिए लागू किया जा सकता है कि पता चलता है. यह vesicles में पुनर्गठित चैनलों एकल श्रृंखला Fv पुस्तकालयों, फैब पुस्तकालयों, आदि इसी तरह के खिलाफ इस्तेमाल किया जा सकता है कि निकट है, अन्य झिल्ली प्रोटीन इन कार्यों के माध्यम से चलाने के लिए और विभिन्न प्रयोजनों के लिए उपयोगी हो सकता है कि उनके तंग बाँधने सुरक्षित कर सकते हैं. हम मानते हैं कि यह पूर्वोत्तरडब्ल्यू विधि भविष्य में और अधिक सामान्य अनुप्रयोगों देखेंगे.

पुनर्गठन सिस्टम झिल्ली झिल्ली प्रोटीन 11 लिपिड प्रभाव के पीछे रासायनिक विवरण की व्याख्या की अनुमति देगा. लिपिड, प्रोटीन बातचीत कई झिल्ली प्रोटीन के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए जाना जाता रहा है, और पिछले 3 में कई अध्ययनों के अधीन कर दिया गया है. सेल आधारित अध्ययन में, जोड़तोड़ झिल्ली में विशिष्ट घटकों को बदलने के लिए लागू किया जा सकता है और फिर झिल्ली प्रोटीन में कार्यात्मक परिवर्तन झिल्ली में संरचनात्मक और compositional परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैं. इस तरह के कनेक्शन अप्रत्यक्ष कर रहे हैं और अच्छी तरह से होती नहीं हैं कि कोशिका झिल्ली में कई कारकों से परिणाम हो सकता है. एक पुनर्गठन सजातीय झिल्ली में, यह झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन और लिपिड संरचना और झिल्ली गुणों में परिवर्तन के बीच संबंध बनाने में अधिक निश्चित है. अंत में, टी समझने के लिएवह लिपिड, प्रोटीन बातचीत के पीछे रासायनिक सिद्धांतों, हम transmembrane डोमेन के आसपास लिपिड का वितरण चित्रित करने के लिए, और प्रोटीन के ठीक बगल में इन लिपिड के गतिशील परिवर्तन को समझने की जरूरत है. एक पुनर्गठन प्रणाली इस तरह के एक समझ की ओर एक विश्वसनीय तरीका प्रतीत होता है.

झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन प्रोटीन / लिपिड / डिटर्जेंट मिश्रित मिसेलस से डिटर्जेंट की नियंत्रित हटाने, और अंत में फफोला 30 में बदल जाते हैं कि बड़े लोगों में मिश्रित मिसेलस के विलय की आवश्यकता है. तीन अलग अलग तरीकों को हटाने डिटर्जेंट, डायलिसिस, मोती, और cyclodextrin 14, 31, 32 के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. लेकिन यह एक छोटी मात्रा 33, 34 से डिटर्जेंट की एक अच्छी तरह से नियंत्रित, क्रमिक हटाने को प्राप्त करने के लिए मुश्किल बना हुआ है. डिटर्जेंट हटाने के लिए एक आदर्श तरीका एक चलाया गति में पूरी मात्रा में समान रूप से जलीय चरण से बाहर डिटर्जेंट ले जाएगा, और मजबूत हस्तक्षेप ओ खींचना नहीं चाहिएbilayer झिल्ली के पुनर्गठन n. इस तरह की एक विधि पुनर्गठन की गति और प्रभावकारिता को बदलने में सक्षम हो सकता है, और अधिक संभावना एक छोटी मात्रा में पुनर्गठन सक्षम हो जाएगा. धीमी गति से कमजोर पड़ने और डिटर्जेंट हटाने के लिए तीन पारंपरिक तरीकों में से किसी का संयोजन इस लक्ष्य दृष्टिकोण हो सकता है. प्रोटीन / डिटर्जेंट / लिपिड मिश्रण में पानी की छोटी राशि के शुरू करने से धीमी गति से कमजोर पड़ने समान रूप से अपनी सीएमसी के लिए डिटर्जेंट एकाग्रता नीचे कम करने के लिए एक चलाया हुआ तरीका है. डिटर्जेंट हटाने के बाद में बड़ी सख्या में छोटे vesicles के संलयन के लिए अब भी महत्वपूर्ण है, हालांकि, पुटिका गठन के लिए कम महत्वपूर्ण है. नियंत्रित डिटर्जेंट हटाने को प्राप्त करने के अन्य तरीकों अभी भी गर्भवती हुई और विकसित करने की आवश्यकता है.

हमारी पुनर्गठन प्रक्रिया मिश्रित मिसेलस और vesicles के साथ ही मिश्रित मिसेलस की डिटर्जेंट प्रेरित संलयन के बीच लिपिड वितरण का विचार रखती है. इसकी सफलता आर के आवेदन की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए प्रमुख मार्ग प्रशस्तहम प्रस्तुत तीन दिशाओं से बहुत अधिक econstituted पुटिका,. अन्य झिल्ली प्रोटीन के लिए हमारी प्रक्रिया का अनुकूलन प्रमुख तकनीकी सीमा का सामना नहीं करना चाहिए. कई झिल्ली प्रोटीन एक तरह से या किसी अन्य का पुनर्गठन किया गया है, भले ही यह पूरी पुनर्गठन के पास प्राप्त करने के लिए और कई अलग अलग दृष्टिकोण से प्रोटीन की कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल हो गया है. KvAP पुनर्गठन में हमारे प्रयास हमारे तरीकों पूर्ण पुनर्गठन अनुमति दे सकता है और इन उद्देश्यों के लिए उपयुक्त हो जाएगा कि सुझाव.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

जियांग प्रयोगशाला में KvAP पर पढ़ाई रॉकफेलर विश्वविद्यालय में डॉ. रॉड्रिक MacKinnon की प्रयोगशाला से महत्वपूर्ण मदद प्राप्त किया है. विशेष धन्यवाद उनकी सलाह के लिए डॉ. Kathlynn ब्राउन और माइकल McQuire जाने के लिए और हमारे फेज स्क्रीन प्रयोगों पर मदद करते हैं. इस काम एनआईएच (क्यू XJ को GM088745 और GM093271) और अहा (क्यू XJ को 12IRG9400019) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tryptone RPI Corp. T60060
Yeast Extract RPI Corp. Y20020
NaCl Fisher S271-3
Tris Base RPI Corp. T60040
Potassium Chloride Fisher BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside Affymetrix D322S Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside Affymetrix O311 Ana-grade
Aprotinin RPI Corp. A20550-0.05
Leupeptin RPI Corp. L22035-0.025
Pepstatin A RPI Corp. P30100-0.025
PMSF SIGMA P7626
Dnase I Roche 13407000
Bio-Bead SM-2 Bio-Rad 152-3920
HEPES RPI Corp. H75030
POPE Avanti Polar Lipids 850757C
POPG Avanti Polar Lipids 840457C
DOGS Avanti Polar Lipids 870314C
DMPC Avanti Polar Lipids 850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids 870282C
DOTAP Avanti Polar Lipids 890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet 29200
Dialysis Tubing Spectrum Laboratories, Inc 132-570
Pentane Fisher R399-1
Decane TCI America D0011
MTS-PEG5000 Toronto Research Cemicals M266501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
  2. Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203 (2005).
  3. Lee, A. G. How lipids affect the activities of integral membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1666, 62 (2004).
  4. Anderson, R. G. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67, 199 (1998).
  5. Simons, K., Vaz, W. L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 269 (2004).
  6. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 257 (2003).
  7. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S. Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. J. Vis. Exp. (20), e1033 (2008).
  8. Zheng, H., Liu, W., Anderson, L. Y., Jiang, Q. X. Lipid-dependent gating of a voltage-gated potassium channel. Nat. Commun. 2, 250 (2011).
  9. Schmidt, D., Jiang, Q. X., MacKinnon, R. Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors. Nature. 444, 775 (2006).
  10. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422, 180 (2003).
  11. Jiang, Q. X., Gonen, T. The influence of lipids on voltage-gated ion channels. Curr. Opin. Struct. Biol. 3408884 (2012).
  12. Artimo, P., et al. ExPASy: SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40, W597 (2012).
  13. Cladera, J., Rigaud, J. L., Villaverde, J., Dunach, M. Liposome solubilization and membrane protein reconstitution using Chaps and Chapso. Eur. J. Biochem. 243, 798 (1997).
  14. Levy, D., Bluzat, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. A systematic study of liposome and proteoliposome reconstitution involving Bio-Bead-mediated Triton X-100 removal. Biochim. Biophys. Acta. 1025, 179 (1990).
  15. Young, H. S., Rigaud, J. L., Lacapere, J. J., Reddy, L. G., Stokes, D. L. How to make tubular crystals by reconstitution of detergent-solubilized Ca2(+)-ATPase. Biophys. J. 72, 2545 (1997).
  16. Levy, D., Gulik, A., Bluzat, A., Rigaud, J. L. Reconstitution of the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase: mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1107, 283 (1992).
  17. Cohen, F. S., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Fusion of phospholipid vesicles with planar phospholipid bilayer membranes. II. Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane. The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).
  18. Fuks, B., Homble, F. Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids. Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).
  19. Hanke, W., Schlue, W. -R. Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications. Biological Techniques. Sattelle, D. B. Academic Press, Inc. San Diego. 133 (1993).
  20. Tien, H. T. Bilayer lipid membranes (BLM). Theory and Practice. Marcel Dekker, Inc. New York. 655-65 (1974).
  21. Pagano, R. E., Ruysschaert, J. M., Miller, I. R. The molecular composition of some lipid bilayer membranes in aqueous solution. The Journal of Membrane Biology. 10, 11 (1972).
  22. Henn, F. A., Thompson, T. E. Properties of lipid bilayer membranes separating two aqueous phases: composition studies. Journal of Molecular Biology. 31, 227 (1968).
  23. Tao, X., MacKinnon, R. Functional analysis of Kv1.2 and paddle chimera Kv channels in planar lipid bilayers. J. Mol. Biol. 382, 24 (2008).
  24. Cohen, F. S., Akabas, M. H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes. The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).
  25. Smith, G. P., Petrenko, V. A. Phage Display. Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).
  26. McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. C. Biopanning of phage displayed peptide libraries for the isolation of cell-specific ligands. Methods Mol. Biol. 504, 291 (2009).
  27. Rigaud, J. L. Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals. Braz. J. Med. Biol. Res. 35, 753 (2002).
  28. Chami, M., et al. Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins. J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).
  29. Kuhlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of membrane proteins. Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).
  30. Rigaud, J. L., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods Enzymol. 372, 65 (2003).
  31. Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. J. Struct. Biol. 121, (2), 142 (1998).
  32. Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin. J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).
  33. Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).
  34. Iacovache, I., et al. The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife. J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics